Основы электронного парамагнитного резонанса и его применение к исследованию свободных радикалов. Ядерный магнитный резонанс. Химический сдвиг. Основы ЯМР-томографии.
Магнитный резонанс
Избирательное поглощение электромагнитных волн определенной частоты веществом в постоянном магнитном поле, обусловленное переориентацией магнитных моментов ядер, называют ядерным магнитным резонансом .
ЯМР можно наблюдать при выполнении условия (h = g я я В , где g я - ядерный множитель Ланде ) лишь для свободных атомных ядер. Экспериментальные значения резонансных частот ядер, находящихся в атомах и молекулах, не соответствуют условию. При этом происходит «химический сдвиг», который возникает в результате влияния локального (местного) магнитного поля, создаваемого внутри атома электронными токами, индуцированными внешним магнитным полем. В результате такого «диамагнитного эффекта» возникает дополнительное магнитное поле, индукция которого пропорциональна индукции внешнего магнитного поля, но противоположна ему по направлению. Поэтому полное эффективное магнитное поле, действующее на ядро, характеризуется индукцией В эф = (1 ) В , где - постоянная экранирования, по порядку величины равная 10 -6 и зависящая от электронного окружения ядер.
Отсюда следует, что для данного типа ядер, находящихся в различных окружениях (разные молекулы или разные, не эквивалентные места одной и той же молекулы), резонанс наблюдается при различных частотах. Это и определяет химический сдвиг. Он зависит от природы химической связи, электронного строения молекул, концентрации данного вещества, типа растворителя, температуры и т. д.
Если два или несколько ядер в молекуле экранированы по-разному, т. е. ядра в молекуле занимают химически не эквивалентные положения, то они имеют различный химический сдвиг. Спектр ЯМР такой молекулы содержит столько резонансных линий, сколько химически не эквивалентных групп ядер данного типа в ней имеется. Интенсивность каждой линии пропорциональна числу ядер в данной группе.
В спектрах ЯМР различают два типа линий по их ширине. Спектры твердых тел имеют большую ширину, и эту об ласть применения ЯМР называют ЯМР широких линий. В жидкостях наблюда ют узкие линии, и это называют ЯМР высокого разрешения.
По химическому сдвигу, числу и положению спектральных линий можно установить структуру молекул.
Химики и биохимики широко используют метод ЯМР для исследования структуры от простейших молекул неорганических веществ до сложнейших молекул живых объектов. Одним из преимуществ этого анализа является то, что он не разрушает объектов исследования.
Интроскопия – визуальное наблюдение предметов или процессов внутри оптических непрозрачных тел, в непрозрачных тел, в непрозрачных средах (веществах).
Достоинством метода ЯМР-томографии является его высокая чувствительность в изображении мягких тканей, а также высокая разрешающая способность, вплоть до долей миллиметра. В отличие от рентгеновской томографии ЯМР-томография позволяет получить изображение исследуемого объекта в любом сечении.
Магнитный резонанс - избирательное поглощение электромагнитных волн веществом, помещенным в магнитное поле.
В зависимости от типа частиц - носителей магнитного момента - различают электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР) .
ЭПР происходит в веществах, содержащих парамагнитные частицы: молекулы, атомы, ионы, радикалы, обладающие магнитным моментом, обусловленным электронами. Возникающее при этом явление Зеемана объясняют расщеплением электронных уровней. Наиболее распространен ЭПР на частицах с чисто спиновым магнитным моментом.
У словие резонансного поглощения энергии :
Магнитный резонанс наблюдается, если на частицу одновременно действуют постоянное поле индукции В рез и электромагнитное поле с частотой . Обнаружить резонансное поглощение можно двумя путями : либо при неизменной частоте плавно изменять магнитную индукцию, либо при неизменной магнитной индукции плавно изменять частоту. Технически более удобным оказывается первый вариант.
Форма и интенсивность спектральных линий, наблюдаемых в ЭПР, определяются взаимодействием магнитных моментов электронов, в частности спиновых, друг с другом, с решеткой твердого тела и т. п.
При электронном парамагнитном резонансе наряду с поглощением энергии и увеличением населенности верхних подуровней происходит и обратный процесс - безызлучательные переходы на нижние подуровни, энергия частицы передается решетке.
Процесс передачи энергии частиц решетке называют спин-ре шеточной релаксацией, он характеризуется временем .
Современная методика измерения ЭПР основывается на определении изменения какого-либо параметра системы, происходящего при поглощении электромагнитной энергии.
Прибор, используемый для этой цели называют ЭПР-спектро метром. Он состоит из следующих основных частей (рис. 25.5): 1 - электромагнит, создающий сильное однородное магнитное поле, индукция которого может плавно изменяться; 2 - генератор СВЧ-излучения электромагнитного поля; 3 - специальная «поглощающая ячейка», которая концентрирует падающее СВЧ-излучение на образце и позволяет обнаружить поглощение энергии образцом (объемный резонатор); 4 - электронная схема, обеспечивающая наблюдение или запись спектровЭПР; 5 - образец; 6 - осциллограф.
В современных ЭПР-спектрометрах используют частоту около 10 ГГц
Одно из медико-биологических применений метода ЭПР заключается в обнаружении и исследовании свободных радикалов. ЭПР широко используют для изучения фотохимических процессов, в частности фотосинтеза. Исследуют канцерогенную активность некоторых веществ. С санитарно-гигиенической целью метод ЭПР используют для определения концентрации радикалов в воздушной среде.
ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………….2
1.ПРИНЦИП МЕТОДА ЭПР…………………………………………………..3
1.1. История открытия метода ЭПР……………………………………………..3
1.2. Механический и магнитный моменты электрона…………………………4
1.3. Эффект Зеемана…………...............................................................................6
1.4. Основное уравнение резонанса……………………………………………8
2. ХРАКТЕРИСТИКА СПЕКТРОВ ЭПР ………………………………….10
2.1. Амплитуда сигнала, форма линии и ширина линии…………………….10
2.2. Сверхтонкая структура спектров ЭПР………………………………….16
……………………………………………………………..18
3.УСТРОЙСТВО РАДИОСПЕКТРОМЕТРА ЭПР……………………...22
4.ПРИМЕНЕНИЕ ЭПР В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ………………………………………………………….24
4.1.Сигналы ЭПР, наблюдаемые в биологических системах………………..24
4.2. Метод спиновых меток и зондов…………………………………………26
4.3. Метод спиновых ловушек………………………………………………...35
ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………...39
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ………………………..40
ВВЕДЕНИЕ
Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР, электронный спиновый резонанс), явление резонансного поглощения электромагнитного излучения парамагнитными частицами, помещенными в постоянное магнитное поле, обусловленное квантовыми переходами между магнитными подуровнями парамагнитных атомов и ионов (эффект Зеемана). Открыт Завойским Евгением Константиновичем в Казанском государственном университете в 1944 г.
В отсутствие постоянного магнитного поля Н магнитные моменты неспаренных электронов направлены произвольно, состояние системы таких частиц вырождено по энергии. При наложении поля Н проекции магнитных моментов на направление поля принимают определенные значения и вырождение снимается (эффект Зеемана), т. е. происходит расщепление уровня энергии электронов E 0 .
Так как на нижнем уровне число электронов больше в соответствии с распределением Больцмана, то преимущественно будет происходить резонансное поглощение энергии переменного магнитного поля (его магнитной составляющей).
Для непрерывного наблюдения поглощения энергии условия резонанса недостаточно, т.к. при воздействии электромагнитного излучения произойдет выравнивание заселенностей подуровней (эффект насыщения). Для поддержания больцмановского распределения заселенностей подуровней необходимы релаксационные процессы.
Основные параметры спектров ЭПР - интенсивность, форма и ширина резонансной линии , g-фактор, константы тонкой и сверхтонкой (СТС) структуры.
1.ПРИНЦИП МЕТОДА ЭПР
1.1.История открытия метода ЭПР
Метод электронного парамагнитного резонанаса (ЭПР, EPR electron paramagnetic resonance , ESR electron spin resonance ) является основным методом для изучения парамагнитных частиц. К парамагнитным частицам имеющим важное биологическое значение относятся два основных типа это свободные радикалы и комплексы металлов переменной валентности (таких как Fe, Cu, Co, Ni, Mn).
Метод электронного парамагнитного резонанса был открыт в 1944 г. Е.К. Завойским при исследовании взаимодействия электромагнитного излучения микроволнового диапазона с солями металлов. Он заметил, что монокристалл CuCl2, помещенный в постоянное магнитное поле 40 Гаусс (4 мТл), может поглощать излучение с частотой около 133 Мгц.
Пионерами применения ЭПР в биологических исследованиях в СССР были Л.А. Блюменфельд и А.Э. Калмансон, которые начали изучать свободные радикалы белков, полученные под действием ионизирующего излучения.
Со временем, синтез стабильных нитроксильных радикалов существенно расширил область применения метода ЭПР в биологических и медицинских исследованиях. Сегодня этот метод является одним из широко используемых методов современной науки.
1.2. Механический и магнитный моменты электрона
В основе метода ЭПР лежит поглощение электромагнитного излучения радиодиапазона неспаренными электронами, находящимися в магнитном поле.
Хорошо известно, что электрон в атоме участвует в орбитальном и спиновом движении, которые можно охарактеризовать с помощью соответствующих механических и магнитных моментов. Так, орбитальный магнитный момент связан с механическим выражением
(1)
где -магнитный орбитальный момент, а -механический орбитальный момент. В свою очередь механический орбитальный момент может быть выражен через орбитальное квантовое число
(2)
Подставив выражение (1.2) в (1.1) получим, что
Величина является элементарным магнитным моментом и носит название магнетон Бора для электрона. Она обозначается буквой β и равна 9,27·1024 Дж/Тл.
Для спинового магнитного момента можно написать аналогичные выражения
(4)
(5)
(6)
где спиновый магнитный момент, Ps механический магнитный момент, а s спиновое квантовое число. Важно отметить, что коэффициент пропорциональности между и Ps (e/m ) вдвое больше, чем для и Pl (e/2m ).
В итоге полный магнитный момент электрона, являющийся вектором, будет равен сумме векторов орбитального и спинового магнитных моментов
(7)
Поскольку абсолютные значения и могут сильно отличаться, то для удобства учета вклада орбитального и спинового магнитных моментов в суммарный магнитный момент электрона вводят коэффициент пропорциональности, показывающий долю каждого из моментов в полном магнитном моменте величину g или g -фактор.
где Pj полный механический момент электрона, равный Pl + Ps . g -Фактор равен единице при s = 0 (т.е. при отсутствии спинового движения) и равен двум, если орбитальный момент равен нулю ( l = 0). g -Фактор идентичен фактору спектроскопического расщепления Ланде и может быть выражен через полные квантовые числа S , P и J :
где (9)
Поскольку в большинстве случаев электронные орбитали сильно отличаются от сферических, то орбитальный магнитный момент дает относительно небольшой вклад в суммарный магнитный момент. Для упрощения вычислений этим вкладом можно пренебречь. Кроме того, если заменить спиновый механический момент его проекцией на выделенное направление (например, на направление магнитного поля), то мы получим следующее выражение:
(10)
где eh/4πm магнетон Бора, а магнитное квантовое число, являющееся проекцией спинового магнитного момента на выделенное направление и равное ±1/2.
1 .3. Эффект Зеемана
Рисунок 1 Ориентация электронов во внешнем магнитном поле ( H ).
В отсутствие внешнего магнитного поля магнитные моменты электронов ориентированы случайным образом (рис.1 слева), и их энергия практически не отличается друг от друга (Е0). При наложении внешнего магнитного поля магнитные моменты электронов ориентируются в поле в зависимости от величины спинового магнитного момента (рис.1. справа), и их энергетический уровень расщепляется на два (рис.2).
Рисунок 2 Расщепление энергетических уровней одиночных электронов в магнитном поле (эффект Зеемана).
Энергия взаимодействия магнитного момента электрона с магнитным полем выражается уравнением
(11)
где μ суммарный магнитный момент электрона, Н напряженность магнитного поля, а cos(μH) косинус угла между векторами μ и Н.
В нашем случае энергия взаимодействия электрона с внешним магнитным полем составит величину
(12)
а разница в энергии между двумя уровнями составит
(13)
Таким образом энергетические уровни электронов, помещенных в магнитное поле, расщепляются в этом поле в зависимости от величины спинового магнитного момента и интенсивности магнитного поля (эффект Зеемана ) .
1.4.Основное уравнение резонанса
Количество электронов в изучаемой системе, имеющих ту или иную энергию, будет определяться в соответствии с распределением Больцмана, а именно
(14)
где и количество электронов на более высоком или более низком энергетическом уровне, соответствующем магнитному моменту электрона со спином +1/2 или 1/2.
Если на систему электронов, находящуюся в магнитном поле, падает электромагнитная волна, то при определенных значениях величины энергии падающих квантов будут происходить переходы электронов между уровнями.
Необходимое условие равенство энергии падающего кванта (hν) и разности энергий между уровнями электронов с различными спинами (gβH).
ΔE = hν = gβH (15)
Это уравнение выражает основное условие поглощения энергии электронами и называется основным уравнением резонанса . Под влиянием излучения электроны, находящиеся на более высоком энергетическом уровне, будут испускать энергию и возвращаться на нижний уровень, это явление называется индуцированной эмиссией. Электроны же, находящиеся на нижнем уровне, будут поглощать энергию и переходить на более высокий
энергетический уровень, это явление называется резонансным поглощением . Поскольку вероятности одиночных переходов между энергетическими уровнями равны, а общая вероятность переходов пропорциональна количеству электронов, находящихся на данном энергетическом уровне, то поглощение энергии будет преобладать над ее излучением. Это связано с тем, что как следует из распределения Больцмана заселенность нижнего уровня выше заселенности верхнего энергетического уровня.
Следует помнить, что различие в уровнях энергии электрона в магнитном поле (а также и других заряженных частиц, обладающих спином, например, у протонов) связано с наличием у электрона собственного магнитного момента. У спаренных электронов магнитные моменты скомпенсированы, и они на внешнее магнитное поле не реагируют, поэтому обычные молекулы не дают сигналов ЭПР. Таким образом, ЭПР позволяет обнаруживать и изучать свойства свободных радикалов (имеющих неспаренный электрон на внешних орбиталях) и комплексов металлов переменной валентности (у которых неспаренный электрон принадлежит более глубоким электронным оболочкам). Эти две группы парамагнитных частиц часто называют парамагнитными центрами.
2.ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕКТРОВ ЭПР
Метод ЭПР позволяет нам изучать свойства парамагнитных центров посредством спектров поглощения электромагнитного излучения этими частицами. Зная характеристики спектров можно судить и о свойствах парамагнитных частиц. К основным характеристикам спектров относятся амплитуда, ширина линии, форма линии, g -фактор и сверхтонкая структура спектров.
2.1. Амплитуда сигнала, форма линии и ширина линии
Амплитуда сигнала
Сигнал ЭПР представляет собой первую производную от спектра поглощения (рис. 3). Площадь под линией поглощения пропорциональна концентрации парамагнитных частиц в образце. Таким образом, концентрация парамагнитных центров пропорциональна первому интегралу под линией поглощения или второму интегралу от спектра ЭПР. Если два сигнала имеют одинаковую ширину, то концентрации парамагнитных центров соотносятся как амплитуды сигналов в спектрах поглощения.
Рисунок 3 - Сигнал ЭПР. Слева зависимость поглощения СВЧ от напряженности магнитного поля (H); справа первая производная этой зависимости. ЭПР-спектрометры регистрируют кривые второго типа.
Для определения концентрации измеряют площади под кривой поглощения у образца сравнения с известной концентрацией парамагнитных центров и у измеряемого образца и неизвестную концентрацию находят из пропорции, при условии, что оба образца имеют одинаковый объем:
(16)
где и концентрации измеряемого образца и образца сравнения соответственно, а S x и S 0 площади под линиями поглощения измеряемого сигнала и образца сравнения.
Для определения площади под линией поглощения неизвестного сигнала можно воспользоваться приемом численного интегрирования
(17)
где f "(H ) первая производная линии поглощения (спектр ЭПР), F (H ) функция линии поглощения, а H напряженность магнитного поля.
(18)
Учитывая, что F (H ) . H в точках -∞ и ∞ равно нулю и dF (H ) равно f "(H ) dH , получим
(19)
где f "(H ) первая производная от линии поглощения, или спектр ЭПР. От интеграла легко перейти к интегральной сумме, учитывая, что H = nΔH , получим
(20)
где Δ H шаг изменения магнитного поля, а n i номер шага. Таким образом, площадь под кривой поглощения будет равна произведению квадрата величины шага магнитного поля на сумму произведений амплитуды спектра ЭПР на номер шага. Из выражения (20) легко видеть, что при больших n (т.е. вдали от центра сигнала) вклад удаленных частей спектра может быть достаточно большим даже при малых значениях амплитуды сигнала.
Форма линии
Хотя согласно основному уравнению резонанса поглощение происходит только при равенстве энергии падающего кванта разности энергии между уровнями неспаренных электронов, спектр ЭПР является непрерывным в некоторой окрестности точки резонанса. Функция, описывающая сигнал ЭПР называется функцией формы линии. В разбавленных растворах, когда можно пренебречь взаимодействием между парамагнитными частицами, кривая поглощения описывается функцией Лоренца:
(21)
где функция кривой поглощения в точке резонанса, значение поля в точке резонанса, ширина сигнала на половине высоты. Аналогичные обозначения используются для кривой поглощения, описываемой функцией Гаусса.
(22)
Функция Гаусса является огибающей спектра ЭПР если между парамагнитными частицами существует взаимодействие. Учитывать форму линии особенно важно при определении площади под кривой поглощения. Как видно из вышеприведенных формул у Лоренцевой линии более медленное убывание и соответственно более широкие крылья, что может давать значительную ошибку при интегрировании спектра.
Ширина линии
Ширина спектра ЭПР зависит от взаимодействия магнитного момента электрона с магнитными моментами окружающих ядер (решетки) (спин-решеточное взаимодействие) и электронов (спин-спиновое взаимодействие). В отсутствие этих взаимодействий энергия, поглощенная электронами, приводила бы к снижению разности заселенности уровней и прекращению поглощения.
Однако, в эксперименте изменения разности заселенности уровней не наблюдается благодаря тому, что существуют процессы, в которых поглощенная энергия передается окружению и электроны возвращаются на исходный уровень. Такие процессы называются процессами релаксации, они поддерживают постоянной разность заселенности энергетических уровней. Механизм релаксации заключается в передаче электромагнитной энергии кванта решетке или окружающим электронам и возвращении электрона на
низкоэнергетический уровень. Время, в течение которого электрон пребывает на высокоэнергетическом уровне, называется временем релаксации. Соответственно существует время спин-решеточной (Т 1) и спин-спиновой (Т 2) релаксации.
Одна из причин уширения полос поглощения в сигналах ЭПР кроется в волновых свойствах элементарных частиц, которые проявляются в существовании известного принципа соотношения неопределенностей Гейзенберга. Согласно этому принципу, чем точнее задано время наблюдения (чем меньше Δ t ), тем больше неопределенность в величине энергии частицы (:
(23)
Если принять, что Δ t это время релаксации T , а Δ Е соответствует g βΔ H , то мы получим, что
(24)
т.е. неопределенность в ширине линии обратно пропорциональна времени релаксации. Наблюдаемое время релаксации считают суммой времени спин-решеточной и спин-спиновой релаксации.
(25)
Свободные радикалы в растворах имеют Т1>> T 2, следовательно ширина линии будет зависеть в основном от Т2.
«Естественное» уширение сигнала ЭПР, зависящее от времени спин-решеточной и спин-спиновой релаксации не единственный механизмам, влияющий на ширину линии c игнала. Важную роль играют также диполь-дипольное взаимодействие ; анизотропия g -фактора; динамическое уширение линии и спиновый обмен.
В основе диполь-дипольного взаимодействия лежит взаимодействие магнитного момента неспаренного электрона с локальным магнитным полем, создаваемым соседними электронами и ядрами. Напряженность магнитного поля в точке, где находится неспаренный электрон, зависит от взаимной ориентации магнитных моментов неспаренного электрона и другого электрона или ядра и расстояния между этими центрами. Изменение энергии неспаренного электрона определяется уравнением
(26)
где μ магнитный момент электрона, θ угол между взаимодействующими магнитными моментам R расстояние между ними.
Вклад анизотропии g-фактора в уширение линии ЭПР связан с тем, что орбитальное движение электрона создает магнитное поле, с которым взаимодействует спиновый магнитный момент. Это создает сдвиг величины напряженности внешнего поля, при которой наблюдается резонанс, т.е. к сдвигу положения максимума сигнала ЭПР. В свою очередь, это проявляется в кажущемся отклонении g -фактора свободного электрона от значения 2,00. С другой стороны, влияние орбитального магнитного поля на электрон
зависит от ориентации молекулы по отношению к внешнему магнитному полю, что приводит к уширению сигнала ЭПР при измерении в системе, состоящей из множества хаотически ориентированных молекул.
Уширение сигнала ЭПР может быть связано также с взаимным превращением двух парамагнитных частиц. Так, если каждая из частиц имеет свой спектр ЭПР, то увеличение скорости взаимного превращения друг в друга будет приводить к уширению линий, т.к. при этом уменьшается время жизни радикала в каждом состоянии. Такое изменение ширины сигнала называется динамическим уширением сигнала.
Спиновый обмен является еще одной из причин уширения сигнала ЭПР. Механизм уширения сигнала при спиновом обмене заключается в изменении направления спинового магнитного момента электрона на противоположное при соударении с другим неспаренным электроном или иным парамагнетиком. Поскольку при таком соударении уменьшается время жизни электрона в данном состоянии, то опять-таки сигнал ЭПР уширяется. Наиболее частым случаем уширения линии ЭПР по механизму спинового обмена является уширение сигнала в присутствие кислорода или парамагнитных ионов металлов .
2.2 Сверхтонкая структура спектров ЭПР
В основе расщепления одиночной линии ЭПР на несколько лежит явление сверхтонкого взаимодействия , т. е. взаимодействия магнитных моментов неспаренных электронов () с магнитными моментами соседних ядер (
На рисунке 4 дано пояснение сверхтонкого взаимодействия. Неспаренный электрон в радикале может быть расположен близко к протону, например как в радикале этанола (1). В отсутствие влияния близлежащих протонов электрон имеет сигнал в форме одиночной линии (2). Однако протон также имеет магнитный момент, который ориентирован во внешнем магнитном поле ( H 0) в двух направлениях (по полю либо против поля) потому, что, подобно электрону, имеет спиновое число S = ½. Будучи маленьким магнитом, протон создает магнитное поле, которое в месте расположения электрона имеет определенные значения +Hp или Hp в зависимости от ориентации протона (3). В результате суммарное магнитное поле, приложенное к неспаренному электрону (4), имеет значение, немного большее (+ Hp) или немного меньшее ( Hp), чем в отсутствии протона (). Поэтому сигнал ЭПР радикала состоит из двух полос, расстояние от которых до прежнего центра полосы равно Hp (5).
Рисунок 4- Сверхтонкое расщепление сигнала ЭПР в радикале этанола.
1 радикал этанола. 2 сигнал ЭПР электрона во внешнем поле. 3 ориентация протонов во внешнем магнитном поле. 4 увеличение или уменьшение поля, действующего на электрон в результате наложения магнитного поля протона ( H p) на внешнее магнитное поле. 5 сигнал ЭПР радикала, в котором магнитное поле протона накладывается на внешнее магнитное поле.
В рассмотренном нами примере спин ядра, взаимодействующего с неспаренным электроном, был равен ± 1/2, что в конечном итоге дало нам расщепление на две линии. Такая величина спина характерна для протонов. У ядер атомов азота (N14) спин целочисленный . Он может принимать значения ±1 и 0. В этом случае при взаимодействии неспаренного электрона с ядром атома азота будет наблюдаться расщепление на три одинаковых линии, соответствующих величине спина +1, 1 и 0. В общем случае число
линий в спектре ЭПР равно 2 m N+1. (см. далее, рис.10)
Естественно, что количество неспаренных электронов и соответственно площадь под кривой поглощения ЭПР не зависят от величины спина ядра и являются постоянными величинами. Следовательно, при расщеплении одиночного сигнала ЭПР на два или три, интенсивность каждой компоненты будет соответственно в 2 или 3 раза ниже.
Очень похожая картина возникает, если неспаренный электрон взаимодействует не с одним, а с несколькими эквивалентными (с одинаковой константой сверхтонкого взаимодействия) ядрами, имеющими магнитный момент отличный от нуля, например двумя протонами. В этом случае возникает три состояния, соответствующие ориентации спинов протонов: (а) оба по полю, (б) оба против поля и (в) один по полю и один против поля. Вариант (в) имеет вдвое большую вероятность, чем (а) или (б), т.к. может быть осуществлен двумя способами. В результате такого распределения неспаренных электронов одиночная линия расщепится на три с соотношением интенсивностей 1:2:1. В общем случае, для n эквивалентных ядер со спином mN число линий равно n 2 m N +1.
2.3. Свойства атомов с магнитными ядрами, константы, СТВ неспаренного электрона с ядром
|
Атом |
Массовое число |
Ядерный спин |
а x 10- 4 Тл |
|
|
99,98 |
||||
|
7,52 |
54,29 |
|||
|
92,48 |
143,37 |
|||
|
316,11 |
||||
|
93,26 |
82,38 |
|||
|
72,15 |
361,07 |
|||
|
27,85 |
1219,25 |
|||
|
819,84 |
В -электронных системах (большинство органических свободных радикалов) спиновая плотность в точке ядра равна нулю (узловая точка р-орбитали) и реализуются два механизма возникновения СТВ (спинового переноса): конфигурационное взаимодействие и эффект сверхсопряжения. Механизм конфигурационного взаимодействия иллюстрируется рассмотрением СН-фрагмента (рис. 5). Когда на р-орбитали появляется неспаренный электрон , его магнитное поле взаимодействует с парой электронов -связи С Н так, что происходит их частичное распаривание (спиновая поляризация), в результате чего на протоне появляется отрицательная спиновая плотность , поскольку энергии взаимодействия спинов и различны. Состояние, указанное на рис. 5, а, более устойчиво, так как для углеродного атома , несущего неспаренный электрон , в соответствии с правилом Хунда реализуется максимальная мультиплетность . Для систем этого типа существует связь между константой СТВ с протоном и спиновой плотностью на соответствующем углеродном атоме , определяемая соотношением Мак-Коннела: где Q = -28 x 10 -4 Тл, - спиновая плотность на атоме углерода . Спиновый перенос по механизму конфигурационного взаимодействия реализуется для ароматических протонов и -протонов в органических свободных радикалах.
Рисунок 5 - Возможные спиновые конфигурации для -орбитали, связывающей атом водорода во фрагменте С Н, и р-орбитали атома углерода со спином а - спины на связывающей -орбитали и р-орбитали атома углерода параллельны, б - те же спины антипараллельны.
Эффект сверхсопряжения заключается в непосредственном перекрывании орбиталей неспаренного электрона и магнитных ядер. В частности, в алкильных радикалах СТВ по этому механизму возникает на ядрах -протонов. Например, в этильном радикале на -протонах СТВ определяется конфигурационным взаимодействием, а на -протонах - сверхсопряжением. Эквивалентность СТВ с тремя протонами метильной группы в рассматриваемом случае обусловлена быстрым вращением группы СН 3 относительно связи С С. В отсутствие свободного вращения (или в случае затрудненного вращения), что реализуется в жидкой фазе для множества систем с разветвленными алкильными заместителями или в монокристаллических образцах, константа СТВ с -протонами определяется выражением , где - двугранный угол между 2р z -орбиталью -углеродного атома и связью СН, В 0 4 x 10 -4 Тл определяет вклад спиновой поляризации по ядерному остову (конфигурационное взаимодействие), B 2 45 x 10 -4 Тл. В пределе быстрого вращения а н = 2,65 x 10- 3 Тл. В спектроскопии ЭПР триплетных состояний (S=1) помимо электрон-ядерных взаимодействий (СТВ) необходимо учитывать взаимодействие неспаренных электронов друг с другом. Оно определяется диполь-дипольным взаимодействием, усредняемым до нуля в жидкой фазе и описываемым параметрами нулевого расщепления D и E, зависящими от расстояния между неспасенными электронами (радикальные пары), а также обменным взаимодействием (изотропным), обусловленным непосредственным перекрыванием орбиталей неспаренных электронов (спиновый обмен), которое описывается обменным интегралом J обм . Для бирадикалов , в которых каждый из радикальных центров имеет одно магнитное ядро с константой СТВ на этом ядре а, в случае быстрого (сильного) обмена J обм а, и каждый неспаренный электрон бирадикальной системы взаимодействует с магнитными ядрами обоих радикальных центров. При слабом обмене (J обм а) регистрируются спектры ЭПР каждого радикального центра независимо, то есть фиксируется "монорадикальная" картина. Зависимость J обм от т-ры и растворителя позволяет получить динамические характеристики бирадикальной системы (частоту и энергетический барьер спинового обмена) .
- УСТРОЙСТВО РАДИОСПЕКТРОМЕТРА ЭПР
Устройство радиоспектрометра ЭПР лишь весьма отдаленно напоминает устройство спектрофотометра для измерения оптического поглощения в видимой и ультрафиолетовой частях спектра (рис. 6).
Рисунок 6 Устройство ЭПР спектрометра.
Источником излучения в радиоспектрометре является клистрон, представляющий из себя радиолампу, дающую монохроматическое излучение в диапазоне сантиметровых волн.
Роль диафрагмы в радиоспектрометре выполняет аттенюатор, позволяющий дозировать мощность, падающую на образец. Кювета с образцом в радиоспектрометре находится в специальном блоке, называемом резонатором. Резонатор представляет собой изготовленный из металла полый параллелепипед, полость которого имеет цилиндрическую или прямоугольную форму. В ней находится поглощающий образец. Размеры резонатора таковы, что входящее излучение образует в нем стоячую электромагнитную волну. Элементом, полностью отсутствующим в оптическом спектрометре, является электромагнит, создающий постоянное магнитное поле, необходимое для расщепления энергетических уровней электронов. Излучение, прошедшее измеряемый образец, попадает на детектор, затем сигнал детектора усиливается и регистрируется на самописце или компьютере. Своеобразие конструкции радиоспектрометра заключается в том, что излучение радиодиапазона передается от источника к образцу и далее к детектору с помощью специальных трубок прямоугольного сечения, служащих волноводами. Размеры сечения волноводов определяются длиной волны передаваемого излучения. Эта особенность передачи радиоизлучения по волноводам и определяет тот факт, что для регистрации спектра ЭПР в радиоспектрометре используется постоянная частота излучения, а условие резонанса достигается изменением величины магнитного поля.
Еще одной важной особенностью радиоспектрометра является то, что этот прибор измеряет не поглощение (A) электромагнитных (свч) волн, а первую производную поглощения по напряженности магнитного поля dA/dH. Дело в том, что для измерения поглощения нужно сравнивать интенсивности прошедшего излучения у измеряемого и контрольного объекта (скажем, пустой кюветы), а при измерении первой производной контрольный объект не нужен. При изменении магнитного поля интенсивность свч волн, прошедших через пустое пространство или непоглощающий объект, не изменяется и первая производная поглощения равна нулю. Если же свч волны проходят через объект с парамагнитными центрами, то поглощение имеет место, а его величина зависит от напряженности магнитного поля. Изменяем поле и изменяется поглощение, что проявляется в изменении интенсивности измеряемого свч колебания. Именно это изменение интенсивности измеряемого свч при небольшой модуляции магнитного поля около заданной его величины позволяет определять dA/dH в каждой точке H, получая тем самым спектры, или сигналы ЭПР .
- ПРИМЕНЕНИЕ ЭПР В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
- Сигналы ЭПР, наблюдаемые в биологических системах
Применение метода ЭПР в биологических исследованиях связано с изучением двух основных видов парамагнитных центров свободных радикалов и ионов металлов переменной валентности. Изучение свободных радикалов в биологических системах связано с трудностью, заключающейся в низкой концентрации свободных радикалов, образующихся при жизнедеятельности клеток. Концентрация радикалов в нормально метаболизирующих клетках составляет по разным источникам примерно М, в то время как современные радиоспектрометры позволяют измерять концентрации радикалов М. Повысить концентрацию свободных радикалов можно затормозив их гибель или повысив скорость их образования. В условиях эксперимента образование
радикалов легче всего наблюдать при облучении биологических объектов при очень низкой температуре (скажем 77К) в ходе их облучения УФ или ионизирующей радиацией. Изучение структуры радикалов более или менее сложных биологически важных молекул, полученных в таких условиях, и было одним из первых направлений применения метода ЭПР в биологических исследованиях (рис.7). Вторым направлением применения метода ЭПР в биологических исследованиях было изучение металлов переменной валентности и/или их комплексов, существующих in vivo . Из-за коротких времен релаксации сигналы ЭПР металлопротеинов тоже можно наблюдать только при низкой температуре, например, температуре жидкого азота или даже гелия.
Рисунок 7 - Спектры ЭПР УФ-облученного цистеина при температуре жидкого азота (77 К) и обычной температуре (300 К).
В качестве примера на рис. 8 дан спектр ЭПР печени крысы. На нем можно увидеть сигналы цитохрома Р-450, имеющие g -фактор 1,94 и 2,25, сигнал метгемоглобина с g - фактором 4,3 и сигнал свободных радикалов, принадлежащий семихинонным радикалам аскорбиновой кислоты и флавинов с g -фактором 2,00.
Рисунок 8 - Спектр ЭПР печени крысы.
Впрочем, сигналы ЭПР некоторых радикалов можно наблюдать и при комнатной температуре. К таким сигналам относятся сигналы ЭПР многих семихинонных или феноксильных радикалов, таких как семихинонный радикал убихинона, феноксильный и семихинонный радикал α-токоферола (витамина Е), витамина D, и многие другие (рис.9).
Рисунок 9 - Сигналы ЭПР семихинонных и феноксильных радикалов.
- Метод спиновых меток и зондов
Важным этапом в развитии применения метода ЭПР в биологических исследованиях стал синтез стабильных свободных радикалов. Среди таких радикалов наибольшую популярность получили нитроксильные радикалы.
Стабильность нитроксильных радикалов обусловлена пространственным экранированием группы NO . , имеющей неспаренный электрон, четырьмя метильными группами, препятствующими протеканию реакции с участием свободной валентности. Однако, такая экранировка не является абсолютной и реакция восстановления свободной валентности все-таки может происходить. Аскорбиновая кислота, например, является хорошим восстановителем нитроксильных радикалов.
Спектр ЭПР нитроксильных радикалов обычно состоит из трех линий равной интенсивности, благодаря взаимодействию неспаренного электрона с ядром атома азота (рис.10).
Рисунок 10 - Формула и спектр ЭПР нитроксильного радикала 2,2,6,6-
тетраметил-пиперидин-1-оксил (ТЕМПО).
Оставим в стороне непростую теорию, объясняющую зависимость формы сигнала ЭПР от подвижности зонда и ограничимся весьма схематическим изложением того, что наблюдается в опытах. Если нитроксильный радикал находится в водном растворе, то его вращение является изотропным и достаточно быстрым, при этом наблюдается сигнал ЭПР, состоящий из трех узких симметричных линий (рис. 11, вверху). При уменьшении скорости вращения наблюдается уширение линий и изменению амплитуды компонент спектра (рис. 11, в середине). Дальнейшее увеличение вязкости среды приводит к еще большему изменению сигнала ЭПР спинового зонда (рис. 11, внизу).
Для количественного описания вращательного движения радикала используют понятие времени вращательной корреляции (τс). Оно равно времени поворота нитроксильного радикала на угол π/2. На основании анализа сигнала ЭПР время корреляции можно оценить, используя эмпирическое уравнение
(27)
Где Δ ширина полосы спектра ЭПР при низком значении поля, а и интенсивность высокопольной и низкопольной компоненты спектра ЭПР. Это уравнение можно использовать при времени корреляции от 5·до с.
Синтез стабильных нитроксильных радикалов семейства ТЕМПО был важным этапом в использовании метода ЭПР для изучения внутренней вязкости биологических мембран и белков решению медико-биологических задач.
Рисунок 11 - Спектр ЭПР ТЕМПО при разных временах вращательной корреляции τс (цифры слева от спектров ).
Однако производные ТЕМПО, имеют, к сожалению, один существенный недостаток - вследствие их амфифильности трудно бывает определить локализацию этого зонда и таким образом ответить на вопрос, где мы, собственно говоря, определяем микровязкость. Эта проблема была практически решена, когда появились так называемые «жирнокислотные спиновые зонды», т.е. соединения, в которых молекула нитроксильного радикала была ковалентно присоединена к молекуле жирной кислоты. В этом случае спектр ЭПР несомненно отражает свойства именно гидрофобной (липидной) фазы изучаемой системы, куда встаивается зонд. На рисунке 12 приведено схематическое строение молекулы жирнокислотного спинового зонда, 5-доксилстеарата, в которой нитроксильный радикал (доксил, соединение родственное ТЕМПО по структуре) присоединен к 5 атому углерода молекулы стеариновой кислоты. Характеристикой движения такого зонда служит величина, называемая параметром упорядоченности S , который характеризует степень асимметрии вращания зонда относительно продольной и поперечной осей его молекулы. Найти параметр упорядоченности можно из характеристик спектра ЭПР по эмпирическому уравнению
(28)
где A|| и A ⊥ параметры, указанные на рисунке. Теоретически, параметр упорядоченности может изменяться от 0 до 1, с изменением вязкости и структурированности мембраны. При совершенно симметричном вращении, когда скорость вращения вокруг трех осей одинакова (что характерно для сферических частиц в изотропной среде), параметр упорядоченности равен нулю. Параметр упорядоченности равен 1, если ось вращения зонда совпадает с нормалью к мембране, а вращение относительно иных осей полностью отсутствует. При низких температурах или в мембранах из синтетических насыщенных фосфолипидов, вращение зонд вращается преимущественнол вокруг длинной оси молекулы, ориетированной поперек мембраны. При этом параметр упорядоченности имеет высокие значсения. При уменьшении вязкости мембраны значение параметра упорядоченности уменьшается.
Рисунок 12 Химическая формула и спектр ЭПР 5 доксилстеарата.
Очень ценным качеством спиновых зондов, содержащих жирную кислоту, является возможность измерения с их помощью параметра упорядоченности на разном расстоянии от поверхности мембраны, так называемого профиля упорядоченности или профиля вязкости. Для этого используют набор спиновых зондов, которые представляют собой молекулы одной и той же жирной кислоты, которые содержат нитроксильный фрагмент на разном расстоянии от карбоксильной группы. Например, используются спиновые зонды с нитроксильным радикалом у 5, 7, 12 и 16 атома углерода стеариновой кислоты. Набор этих соединений позволяет измерять параметр S на расстоянии 3,5, 5, 8,5 и 10,5 ангстрем от поверхности мембраны (рис.13).
Рисунок 13- Изменение сигнала ЭПР при удалении нитроксильного радикала от полярной карбоксильной группы жирной кислоты.
Обычно спектры ЭПР спинового зонда, включенного в мембрану, и зонда, находящегося в окружающем водном растворе, могут существенно различаться. Это свойство было использовано для создания нового класса спиновых зондов, позволяющих измерять межфазный потенциал мембраны (часто называемый поверхностным потенциалом). Для измерения этого потенциала измеряют коэффициент распределения вода/мембрана нейтрального и заряженного зондов. Поскольку заряженный зонд взаимодействует с зарядами, расположенными на поверхности мембраны, то его коэффициент распределения будет отличаться от такового у нейтрального зонда. Отношение коэффициентов распределения служит мерой поверхностного потенциала изучаемой мембраны. Химическая формула спинового зонда, используемого для измерения поверхностного потенциала приведена на рис.14 .
Рисунок 14 - Химическая формула заряженного спинового зонда.
Еще одним важным применением метода спинового зонда является измерение рН в микрообъемах, например, внутри лизосом или фагосом клеток. Для этих целей применяют специальные рН-чувствительные спиновые зонды (рис. 15). В основе метода рН-метрии с применением спиновых зондов лежит способность зонда давать разные спектры ЭПР в
протонированной и депротонированной формах. Таким образом, в зависимости от рК спинового зонда, существует некоторый диапазон рН в котором и происходит его протонирование и соответствующее изменение спектра ЭПР (рис.16).
Рисунок 15 - Химические формулы рН-чувствительного спинового зонда.
Рисунок 16 - Спектры ЭПР и и зависимость концентрации депротонированного рН- чувствительного спинового зонда от рН
Все о чем до сих пор говорилось в данном разделе касалось метода спиновых зондов . Однако не менее интересным является и метод спиновых меток . В основе метода спиновых меток лежит тот же принцип изменения спектра ЭПР нитроксильного радикала в зависимости от скорости и изотропности его вращения. Отличием же метода является тот факт, что спиновая метка ковалентно связывается с другой более или менее крупной
молекулой.
Одним из первых и удачных применений метода спиновой метки было измерение количества и доступности SH-групп белков (рис.17). Химическая формула и спектр ЭПР спиновой метки, взаимодействующей с сульфгидрильными группами, в свободном состоянии и после присоединения к белку приведены на рис.18.
Рисунок 17 - Схема взаимодействия спинового зонда с тиоловой группой белка.
Из рисунка можно видеть, что спектры ЭПР спиновой метки в свободном и связанном состоянии сильно отличаются, что связано с различием в скорости и направлении вращения. Естественно, что связанная спиновая метка имеет значительно более низкую скорость вращения, чем в свободном виде. Более того, количество связанных спиновых меток и соответственно интенсивность сигнала ЭПР пропорциональны количеству
прореагировавших со спиновой меткой сульфгидрильных групп, что позволяет определять не только подвижность зонда, но и его количество.
Рисунок 18 - Химическая формула спиновой метки для SH-групп и спектры ЭПР иммобилизованной (1), связанной (2) и свободной (3) спиновой метки.
В настоящее время существует множество методических приемов, позволяющих изучать топографию белковой глобулы с использованием спиновых меток. Поскольку многие ионы металлов переменной валентности являются парамагнетиками и кроме того могут находиться в активном центре фермента, то взаимодействие спиновой метки, прикрепленной, например, к остатку цистеина или гистидина белковой глобулы, с ионом металла будет приводить к уширению спектра ЭПР в результате диполь-дипольного взаимодействия парамагнетиков .
- Метод спиновых ловушек
Появление нитроксильных радикалов оказалось решающим событием в решении проблемы обнаружения и исследования свободных радикалов, образующихся в живых системах. Обнаружение радикалов оказалось возможным благодаря появлению метода
спиновых ловушек. Суть метода заключается в том, что некоторое соединение, не являющееся нитроксильным радикалом, но имеющее структуру близкую к нитроксильному радикалу (спиновая ловушка ), взаимодействует со свободным, короткоживущим радикалом и превращается в долгоживущий нитроксильный радикал (спиновый аддукт ), спектр ЭПР которого, уникален для данного радикала или семейства радикалов.
По химической природе спиновые ловушки можно отнести к двум основным классам это нитроны и нитрозосоединения. К нитронам относятся две наиболее популярные спиновые ловушки С-фенил-N-трет-бутил нитрон (ФБН) и 5,5-диметил-пирролин-1- оксил (ДМПО). Реакция взаимодействия ФБН с радикалом выглядит следующим образом:
Стабильность образующегося нитроксильного радикала ФБН (спинового аддукта ) объясняется тем, что атом кислорода, на котором локализован неспаренный электрон, пространственно экранирован тремя метильными группами. Спиновый аддукт радикала обладает уникальным спектром ЭПР (см. рис.19). При этом форма спектров ЭПР спиновых аддуктов зависит от природы присоединившегося свободного радикала. Таким образом удается проводить исследование свободнорадикальных реакций в биологических объектах методом ЭПР при физиологических температурах.
Рисунок 19 - Спектр ЭПР спинового аддукта и значения констант сверхтонкого расщепления для некоторых радикалов.
aH и aN константы сверхтонкого расщепления на протоне и атоме азота соответственно
Рисунок 20 Схема реакции ловушки ДМПО и ОН радикала.
На рис. 20 показана реакция другой спиновой ловушки, ДМПО с гидроксильным радикалом и образование спинового аддукта этого радикала. Опять-таки, измеряя константы сверхтонкого расщепления спектра спинового аддукта можно идентифицировать короткоживущий радикал .
Метод спиновых ловушек занимает одно из важнейших мест в медико-биологических исследованиях, т.к. позволяет обнаруживать и идентифицировать радикалы, образующиеся в живых клетках и тканях. Среди таких радикалов следует отметить супероксидный и гидроксильный радикалы, а также оксид азота. Кроме того, применение метода спиновых ловушек дает возможность иучать антиоксидантные свойства веществ и величину антиоксидантного резерва .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) основан на взаимодействии вещества с магнитным полем. Как следует из названия метода, он применяется для исследования парамагнитных частиц.
Известно, что при помещении парамагнетиков в магнитное поле, парамагнетик втягивается в это поле. Это связано с наличием у парамагнетиков магнитных моментов.Магнитные моменты создаются неспаренными электронами.
Примерами парамагнитных частиц, представляющих интерес для биологов, служат свободные радикалы, являющиеся промежуточными продуктами биохимических реакций, ионы металлов переменной валентности, таких как железо, медь, марганец и др.
Проявление магнитного момента у электрона связано с тем, что электрон является заряженной частицей, и при вращении электрона вокруг своей оси (спиновое движение) возникает магнитное поле, направленное вдоль оси вращения. При помещении парамагнитного образца в магнитное поле магнитные моменты неспаренных электронов ориентируются в этом
поле, подобно тому, как это происходит с магнитными стрелками.
Магнитный момент неспаренного электрона во внешнем магнитном поле может ориентироваться двумя способами - по полю и против поля. Таким образом, если в исследуемой системе имеются неспаренные электроны, наложение внешнего магнитного поля приводит к разделению электронов по группам: магнитные моменты одних электронов ориентированы по полю, других против.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
- Д. Ингрэм Электронный парамагнитный резонанс в биологии [Текст]. Изд-во «Мир», 1972.
- Свободные радикалы в биологических системах [Текст]. т.1, ст.88-175, 178-226. Изд-во «Мир», 1979.
3. Дж. Вертц и Дж. Болтон, Теория и практические приложения метода ЭПР [Текст], Москва: Мир,1975.
4. Современные методы биофизических исследований [Текст]. Практикум по биофизике, под редакцией А.Б. Рубина, Москва: Высшая школа, 1988.
5. Метод спиновых меток [Текст]. Теория и применение, под редакцией Л. Берлинера, Москва: Мир, 1979.
6. А.Н. Кузнецов, Метод спинового зонда, Москва [Текст]: Наука, 1976.
7. В.Е. Зубарев, Метод спиновых ловушек, Москва [Текст]: Издательство МГУ, 1984.
PAGE \* MERGEFORMAT 1
ЭЛЕКТРОННЫЙ ПАРАМАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС (ЭПР) - резонансное поглощение электромагнитных волн веществами, содержащими парамагнитные частицы. Методы, основанные на ЭПР, нашли широкое применение в лабораторной практике. С их помощью изучают кинетику химических и биохимических реакций (см. Кинетика биологических процессов , Кинетика химическая), роль свободных радикалов в процессах жизнедеятельности организма в норме и при патологии (см. Радикалы свободные), механизмы возникновения и течения фотобиологических процессов (см. Фотобиология) и т. д.
Явление ЭПР было открыто советским ученым Б. К. Завойским в 1944 году. Электронный парамагнитный резонанс характерен только для парамагнитных частиц то есть частиц, способных намагничиваться при приложении к ним магнитного поля) с нескомпенсированным электронным магнитным моментом, который, в свою очередь, обусловлен собственным механическим моментом электрона - спином. Электронам присуще особого рода внутреннее движение, которое можно сравнить с вращением волчка вокруг своей оси. Связанный с ним момент количества движения называют спином. Благодаря спину электрон обладает постоянным магнитным моментом, направленным противоположно спину. В большинстве молекул электроны располагаются на орбиталях таким образом, чего их спины направлены противоположно, магнитные моменты скомпенсированы, и сигнал ЭПР от них наблюдать не удается. Если магнитное поле электрона не скомпенсировано спином другого электрона (то есть молекула содержит неспаренные электроны), то регистрируется сигнал ЭПР. Частицами с неспаренными электронами являются свободные радикалы, ионы многих металлов (железо, медь, марганец, кобальт, никель и др.), ряд свободных атомов (водород, азот, щелочные металлы и др.).
В отсутствие внешнего магнитного поля направление (ориентация) магнитного момента электрона в пространстве может быть любым; энергия такого электрона не зависит от ориентации его магнитного момента. В соответствии с законами квантовой механики во внешнем магнитном поле ориентация магнитного момента электрона не может быть произвольной - он может быть направлен либо по направлению магнитного поля, либо противоположно ему.
В соответствии с ориентацией магнитного момента электрона его энергия в магнитном поле также может принимать лишь два значения: минимальное Е1 - при ориентации магнитного момента «по полю» и максимальное Е2 - при его ориентации «против поля» и разница в энергиях этих состояний (дельта Е) вычисляется по формуле: ΔЕ = gβH, где β - магнетон Бора (единица измерения магнитного момента электрона), H - напряженность магнитного поля, g - константа, зависящая от электронной структуры парамагнитной частицы. Если на систему неспаренных электронов во внешнем магнитном поле подействовать электромагнитным излучением, энергия кванта которого равна ΔE, то под влиянием излучения электроны начнут переходить из состояния с меньшей энергией в состояние с большей энергией, что будет сопровождаться поглощением излучения веществом.
ЭПР относят к методам радиоспектроскопии, поскольку для наблюдения электронного парамагнитного резонанса применяются излучения в радиочастотном диапазоне электромагнитных волн.
ЭПР регистрируется с помощью специальных приборов - радиоспектрометров. В их состав входят: электромагнит, источник радиочастотного излучения, линия передачи излучения от источника к образцу (волновод), резонатор, в котором находится исследуемый образец, системы детектирования, усиления и регистрации сигнала. Наиболее распространены радиоспектрометры, в которых используются электромагнитные излучения с длинами волн 3,2 см или 8 мм.
Регистрация сигнала ЭПР производится следующим образом. Напряженность магнитного поля, создаваемого электромагнитом, линейно изменяется в определенных пределах. При значениях напряженности, отвечающих условию резонанса, образец поглощает энергию электромагнитного излучения. Линия поглощения (сигнал ЭПР) представляет собой зависимость мощности излучения, поглощенного образцом, от напряженности магнитного поля. В существующих радиоспектрометрах сигнал ЭПР регистрируется в виде первой производной линии поглощения.
Для описания и анализа спектров ЭПР используется ряд параметров, характеризующих интенсивность линий, их ширину, форму, а также положение в магнитном поле. Интенсивность линий ЭПР при прочих равных условиях пропорциональна концентрации парамагнитных частиц, что позволяет проводить количественный анализ.
При рассмотрении явления ЭПР следует учитывать, что магнитный момент неспаренного электрона взаимодействует не только с магнитным полем электромагнита, но и с магнитными полями, создаваемыми окружением электрона: другими неспаренными электронами, магнитными ядрами (см. Ядерный магнитный резонанс). Взаимодействие неспаренных электронов с ядрами часто приводит к расщеплению спектра ЭПР на ряд линий. Анализ таких спектров позволяет идентифицировать природу парамагнитных частиц, оценивать характер и степень их взаимодействия друг с другом.
Участие парамагнитных частиц в химических реакциях, молекулярное движение и другие кинетические эффекты также влияют на форму спектра ЭПР. Поэтому ЭПР используют для обнаружения, оценки количества и идентификации парамагнитных частиц, исследования кинетики химических и биохимических реакций и молекулярной динамики.
Благодаря своей универсальности ЭПР находит широкое применение в различных областях науки. Использование ЭПР в биологии и медицине обусловлено наличием в клетках, тканях и биол. жидкостях различных по природе парамагнитных центров. С помощью ЭПР было обнаружено наличие свободных радикалов практически во всех животных и растительных тканях. Источником свободных радикалов служат такие соединения, как флавины, коэнзим Q и другие вещества, выполняющие роль переносчиков электронов В реакциях энергетического обмена в растительной и животной клетке; парамагнитные центры, обнаруживаемые в изолированных тканях, принадлежат в основном электрон-транспортным цепям митохондрий, микросом, хлоропластов (см. Дыхание). Обнаружено, что содержание свободных радикалов в тканях коррелирует с их метаболической активностью. В многочисленных работах показано изменение количества свободных радикалов при различных патологических состояниях, например при онкогенезе (см.), развитии лучевых повреждений (см.), токсикозе (см. Интоксикация), что объясняется нарушением энергетического метаболизма при патологии (см. Биоэнергетика).
С помощью ЭПР в тканях животных и растений определяют парамагнитные ионы (железа, меди, марганца, кобальта и т. д.), которые входят в состав металлопротеидов, участвующих в реакциях переноса электронов по электронтранспортным цепям и ферментативном катализе, а также в кислородпереносящих пигментах (гемоглобине). С помощью ЭПР удается исследовать окислительно-восстановительные превращения ионов металлов и характер взаимодействия ионов с их окружением, что позволяет установить тонкую структуру металлосодержащих комплексов.
Патологические изменения тканей приводят к изменениям сигналов ЭПР металлопротеидов, что связывают с распадом парамагнитных комплексов металлов, изменением окружения парамагнитных ионов, переходом ионов в другие комплексы. Однако исследование природы парамагнитных центров тканей, особенно свободных радикалов, связано с определенными трудностями из-за сложности расшифровки спектров ЭПР.
С помощью ЭПР оказалось возможным исследовать механизмы ферментативных реакций (см. Ферменты). В частности, удается одновременно изучать как кинетику образования и расходования свободных радикалов в ходе ферментативных реакций, так и кинетику окислительно-восстановительных превращений металлов, входящих в состав ферментов, что позволяет устанавливать последовательность стадий ферментативной реакции.
Применение ЭПР при исследовании лучевого поражения в биол. объектах позволяет получать информацию о природе образующихся в биополимерах радикалов, о механизмах и кинетике радикальных реакций, развивающихся в облученных объектах и приводящих к биологическому эффекту. Метод ЭПР может быть применен в аварийной дозиметрии, например при случайном облучении людей для оценки дозы облучения, используя для этого предметы из зоны облучения.
Важное место занимает ЭПР в исследовании фотобиологических процессов, протекающих с участием свободных радикалов (см. Молекула , Радикалы свободные , Фотобиология , Фотосенсибилизация). С помощью ЭПР подробно изучают процессы образования свободных радикалов в белках, нуклеиновых кислотах и их компонентах при действии ультрафиолетового излучения, роль этих радикалов в фотодеструкции биополимеров (см. Свет). Применение ЭПР дало важную информацию о первичных механизмах фотосинтеза (см.). Показано, что первичной реакцией фотосинтеза является перенос электрона от возбужденной светом молекулы хлорофилла и образование катион-радикала хлорофилла. Идентифицирована и природа молекул, акцептирующих электрон, отдаваемый возбужденной молекулой хлорофилла.
ЭПР применяется также и для исследования структуры биологически важных макромолекул и биомембран. Например, ионы железа, входящие в состав гема в гемсодержащих белках, могут находиться в высокоспиновом состоянии (электроны на внешних орбитах не спарены, суммарный спин максимален) и низкоспиновом (внешние электроны полностью или частично спарены, спин минимален). Исследования особенностей сигналов ЭПР высокоспиновых и низкоспиновых состояний ионов железа в гемоглобине и его производных способствовали пониманию пространственной структуры молекулы гемоглобина.
Значительные успехи в изучении структуры биомембран и биополимеров были достигнуты после появления методов спиновых зондов и меток (см. Мембраны биологические). В качестве спиновых меток и зондов в основном используются стабильные нитроксильные радикалы (см. Радикалы свободные). Нитроксильный радикал может быть ковалентно связан с молекулами (спиновая метка) либо удерживаться в исследуемой системе за счет физических взаимодействий (спиновой зонд). Сущность заключается в том, что форма спектра ЭПР нитроксильных радикалов зависит от свойств микроокружения: вязкости, характера и молекулярного движения, локальных магнитных полей и др. Спин-метки, ковалентно связанные с различными группами биополимеров, являются индикатором состояния структуры биополимера. С помощью спиновых меток исследуются пространственная структура биополимеров, структурные изменения белков при денатурации, образовании комплексов фермент - субстрат, антиген - антитело и т.д.
С помощью метода спиновых зондов изучаются способы упаковки и подвижность липидов в биомембранах, липид-белковые взаимодействия, структурные переходы в мембранах, вызванные действием различных веществ и т.д. На основе исследования спиновых меток и зондов предложены методы определения лекарственных средств в биол. жидкостях, а также исследуются вопросы направленного транспорта лекарственных средств и т. д.
Таким образом, с помощью ЭПР показано широкое распространение электронных процессов в организме в норме и при возникновении какой-либо патологии. Создание теории и совершенствование техники метода ЭПР легло в основу квантовой электроники как раздела науки, привело к созданию молекулярных генераторов и усилителей радиоволн (мазеров) и света - лазеров (см.), нашедших широкое применение во многих областях народного хозяйства.
Блюменфельд Л. А., Воеводский В. В. и Семенов А. Г. Применение электронного парамагнитного резонанса в химии, Новосибирск, 1962, библиогр.; Вертц Дж. и Болтон Дж. Теория и практические приложения метода ЭПР, пер. с англ.. М., 1975, библиогр.; Ингрэм Д. Электронный парамагнитный резонанс в биологии, пер. с англ.. М., 1972; Калмансон А. Э. Применение метода электронного парамагнитного резонанса в биохимии, в кн.: Усп. биол. хим., под ред. Б. Н. Степаненко, т. 5, с. 289, М., 1963; Кузнецов А. Н. Метод спинового зонда. М., 1976; Лихтенштейн Г. И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии, М., 1974; Метод спиновых меток, под ред. Л. Берлинера, пер. с англ., М., 1979; Свободные радикалы в биологии, под ред. У. Прайора, пер. с англ., т. 1, с. 88, 178, М., 1979.
К. Н. Тимофеев.
Метод ЭПР приобрел большое значение в химии, физике, биологии, медицине, поскольку позволяет определять структуры и концентрации органических и неорганических свободных радикалов. Свободные радикалы могут быть созданы химическим методом, фотохимически или при действии излучения высокой энергии.
Спектр ЭПР дают свободные радикалы, молекулы с нечетным числом электронов, триплетные состояния органических молекул, парамагнитные ионы переходных металлов и их комплексы.
Метод ЭПР начал применятся в биологических исследованиях в 50-ые годы 20 в. Благодаря довольно высокой чувствительности и возможности в определении природы парамагнитных частиц этот метод нашел широкое применение для изучения целого ряда биологических процессов.
Помимо сигналов свободных радикалов в тканях наблюдается целый ряд сигналов металлов (Fe, Cu, Mn, Ni, Co). Эти металлы входят в состав металлопротеинов, принимающих участие в целом ряде ферментативных процессов. Железосодержащие белки (цитохромы, ферредоксины) являются компонентами электрон-транспортных цепей в митохондриях и хлоропластах.
Методом ЭПР исследован целый ряд ферментативных систем, обнаружены свободно-радикальные продукты субстратов. В ряде случаев оказалось возможным наблюдать за окислительно-восстановительными превращениями ионов металлов, входящих в активный центр фермента.
ЭПР-спектроскопия широко применяется в исследованиях фотосинтеза: изучается механизм первичных стадий разделения зарядов в реакционных центрах и дальнейший перенос электрона по цепи электронного транспорта.
Помимо изучения механизмов реакций, протекающих с участием парамагнитных частиц, метод ЭПР широко используют и для исследования структурно-динамических свойств макромолекул и биомембран.
В последнее время для изучения биологических и полимерных систем часто используются методы «парамагнитного зонда», «спиновых меток» и «спиновых ловушек». Все они основаны на использовании стабильных азотнокислых радикалов различного строения, а точнее на анализе изменений ширины линий спектров ЭПР, вызванных вращательной и поступательной диффузией этих радикалов.
Основная идея метода спиновых меток и зондов состоит в присоединении к той или иной функциональной группе белка свободного радикала и изучению характеристик его сигналов ЭПР. Наиболее удобны в этом отношении нитроксильные радикалы, содержащие свободнорадикальную группу:
где R 1 и R 2 – различные химические группировки.
Метод «спиновых меток» заключается в том, что к непарамагнитной молекуле стабильный радикал прикрепляется ковалентной или какой-либо другой связью так, чтобы свободная валентность оказалась незатронутой. Характер движения отчетливо проявляется в форме спектра и служит важным источником информации об исходной молекуле.
Если молекула встраивается в белковую молекулу и там удерживается с помощью электростатических сил или гидрофобных взаимодействий, то такая молекула называется спиновым зондом. Метод основан на исследовании вращательной и поступательной подвижности радикала-зонда в водных или органических средах или в матрице полимера. Подвижность радикала зависит от подвижности молекул окружающей среды, поэтому радикал является своеобразным молекулярным датчиком структурной и динамической информации о локальном окружении.
Форма сигнала ЭПР, даваемого спиновой меткой или зондом, зависит от микроокружения нитроксильного радикала и, в первую очередь, от вращательной подвижности той группы, в состав которой он входит.
Основной недостаток спиновых меток и зондов заключается в том, что хотя эти молекулы и невелики, всё же, включаясь в липидный бислой, они несколько изменяют его свойства.
В основе метода «спиновых ловушек» лежит реакция специально вводимой в исследуемую систему непарамагнитной молекулы (ловушки) с короткоживущим радикалом, при этом образуется стабильный радикал. Кинетическое поведение образующегося стабильного радикала и его структура дают сведения о кинетике и механизме процессов в изучаемой системе.
Объектами исследования в химии с применением ЭПР-спектроскопии являются: 1) свободные радикалы в промежуточных продуктах органических реакций; 2) кинетика реакций; 3) химия поверхностных явлений; 4) разрушение, происходящее в результате облучения; 5) полимеризация, обусловленная свободными радикалами; 6) свободные радикалы, замороженные при низких температурах; 7) металлы переменной валентности и их комплексы.
Метод ЭПР дает ценный вклад в исследование кинетики и механизмов химических реакций. Во-первых, измерение ширины линий в спектрах ЭПР можно использовать для определения констант скорости процессов с участием парамагнитных частиц, характеристическое время жизни которых лежит в интервале 10 -5 -10 -10 с. Во-вторых, метод ЭПР позволяет регистрировать с высокой чувствительностью в разных условиях парамагнитные частицы, что дает ценную информацию о механизмах реакций. В-третьих, спектрометр ЭПР можно использовать как аналитический прибор для детектирования в ходе реакций концентрации реагирующих парамагнитных молекул. Количество парамагнитных центров в образце пропорционально площади под спектром поглощения.
Метод ЭПР широко используется для исследования быстрых процессов, связанных с изменением молекулярной структуры радикалов. Эти процессы включают заторможенное вращение и конформационные переходы.
Для короткоживущих радикалов чувствительность метода может быть повышена путем использования проточной системы или непрерывного облучения. Спектры ЭПР нестабильных радикалов можно получить, зафиксировав их в стеклах, матрицах замороженных благородных газов или кристаллах.
Вопросы для собеседования
1. Теоретические основы метода.
2. Аналитические параметры ЭПР-спектра.
3. Спектрометры ЭПР.
4. Применение ЭПР.
Тестовые задания
1. Условие резонанса в методе ЭПР:
а) n= gH 0 (1-s) / 2p; б) δ = (ΔН/Н 0);·в)hn=gβH 0 ; г) δ = (Δν/ν 0)/(ΔН/Н 0).
2. Что происходит в момент резонанса в методе ЭПР:
а) происходит поглощение квантов излучения, переориентации спинов не происходит;
б) происходит поглощение квантов излучения и переориентации спинов, т.е. переход из нижнего энергетического состояния в верхнее и наоборот. Количество переходов снизу вверх больше числа переходов сверху вниз.
в) происходит поглощение квантов излучения и переориентации спинов, т.е. переход из нижнего энергетического состояния в верхнее и наоборот. Количество переходов сверху вниз больше числа переходов снизу вверх.
3. Параметры спектров ЭПР:
а) g-фактор, ширина полосы поглощения, интенсивность линии поглощения;
б) общее число сигналов, интенсивность сигналов, химический сдвиг, мультиплетность сигнала;
в) g-фактор, ширина полосы поглощения, интенсивность линии поглощения, СТС спектров ЭПР.
МАСС-СПЕКРОМЕТРИЯ
Данный метод принципиально отличается от спектроскопических методов. Методы масс-спектрометрии основаны на ионизации вещества, разделении ионов, согласно отношению (m/z ), и регистрации массы образующихся осколков.
Теоретические и экспериментальные основы масс-спектрометрии были заложены еще Д.Д. Томсоном, который впервые в 1912 г. создал прибор для получения масс-спектра положительных ионов. Однако его прибор имел низкое разрешение. Его ученик Ф. Астон в 1918 г. существенно повысил разрешение и на своем приборе впервые открыл изотопы элементов. Практически одновременно с Ф. Астоном в Чикаго А. Демпстер сконструирован первый масс-спектрометр, в котором анализатором служило поперечное магнитное поле, а ионные токи измерялись электрическими методами. Схема его используется и в современных приборах.
Ионизация молекул должна проводиться в таких условиях, при которых образовавшийся ион вне зависимости от метода ионизации не претерпевал бы никаких столкновений с другими молекулами или ионами. Это необходимо для установления взаимосвязи между свойствами иона и молекулы.
Методы ионизации
Ионизация может проводиться различными методами.
1. Метод ионизации электронным ударом (ЭУ).
Это наиболее распространенный метод получения ионов в связи с простотой и доступностью источников ионов и их высокой эффективностью. Допустим, что через пары вещества проходит поток электронов, энергию которых можно постепенно увеличивать. Если эта энергия достигнет определенного уровня, то при столкновении электрона с молекулой может произойти «выбивание» из нее электрона с образованием молекулярного иона:
многоатомная молекула молекулярный ион (катион-радикал)
Наименьшая энергия бомбардирующих электронов, при которой возможно образование из данной молекулы иона, называется энергией ионизации вещества. Энергия ионизации является мерой прочности, с какой молекула удерживает наименее связанный с ней электрон. Для органических молекул энергия ионизации составляет 9 ÷12 эВ.
Если энергия электронов значительно превышает энергию ионизации, то образующийся молекулярный ион получает избыточную энергию, которой может оказаться достаточно для разрыва в нем связей. Происходит распад молекулярного иона на частицы меньшей массы (фрагменты). Такой процесс называется фрагментацией . В практике масс-спектрометрии используются электроны с энергией 30÷100 эВ, что обеспечивает фрагментацию молекулярного иона.
Молекулярные ионы - это такие ионы, массы которых равны массе ионизируемой молекулы. К сожалению, нет прямых методов определения структуры ионов. Поэтому часто используют предположение о тождественности структуры молекулярного иона (М +) и нейтральной молекулы (М). Вероятность образования молекулярного иона больше для простых, малых молекул. С увеличением числа атомов в молекуле увеличивается вероятность фрагментации молекулярного иона.
Известны два основных типа фрагментации молекулярного иона - диссоциация и перегруппировка.
Диссоциация - распад молекулярного иона с сохранением последовательности связей. В результате процесса образуются катион и радикал:
Диссоциация углеводородов приводит к фрагментам с нечетными значениями отношения m/z.
Перегруппировка сопровождается изменением последовательности связей, в результате чего образуется новый катион-радикал меньшей массы и нейтральная устойчивая молекула (Н 2 О, СО, СО 2 и т.д.):
Перегруппировка углеводородов и кислородсодержащих соединений приводит к фрагменту с четным значением отношения m/z. Измерение массы образующихся осколков и их относительного количества позволяет получить ценную информацию о строении органических соединений.
Рассмотрим устройство масс-спектрометра (рис. 1). Масс-спектрометр должен содержать узлы для выполнения следующих функций: 1) ионизации пробы, 2) ускорение ионов электрическим полем, 3) распределение ионов согласно отношению m/z, 4) детектирование ионов по соответствующему электрическому сигналу.
Рис.1. Устройство масс-спектрометра
1 - источник электронов; 2 - ионизационная камера; 3 - ускорительные пластины (отрицательный потенциал); 4 - магнит; 5 - щель;
6 - коллектор ионов (детектор ионов)
Для получения масс-спектра пары вещества небольшими количествами с помощью специальной системы напуска вводятся в ионизационную камеру (2) , где поддерживается глубокий вакуум (давление 10 -6 мм рт. ст.). Молекулы вещества бомбардируются потоком электронов, излучаемых раскаленным катодом (1). Образующиеся ионы выталкиваются из ионизационной камеры небольшой разностью потенциалов (3). Получаемый поток ионов ускоряется, фокусируется сильным электрическим полем и попадает в магнитное поле (4).
В результате бомбардировки молекул вещества электронами образуются частицы, имеющие положительный или отрицательный заряд, а также нейтральные частицы. При прохождении потока частиц через магнитное поле нейтральные частицы не изменяют направления, а положительные и отрицательные отклоняются в разные стороны. Величины отклонения ионов пропорциональны заряду и обратно пропорциональны их массе.
Каждый отдельный ион, характеризуемый конкретной величиной m/z, при данной напряженности магнитного поля движется по собственной траектории. Интервал сканирования масс можно изменять, варьируя либо напряженностью магнитного поля, либо потенциалом электрического поля.
В обычной масс-спектрометрии принято регистрировать только частицы, имеющие положительный заряд, т.к. при бомбардировке молекул электронами положительно заряженных ионов обычно больше, чем отрицательно заряженных. Если необходимо изучать и отрицательно заряженные ионы, следует изменить знак потенциала ускорения (ускорительные пластины).
Если на выходе ионов из магнитного поля установить регистрирующее устройство, то частицы, различающиеся значениями m/z, будут давать раздельные сигналы. Интенсивность сигналов будет пропорциональна количеству частиц с данным значением m/z. Интенсивность сигналов определяется как их высота, выраженная в мм. Высота пика с максимальной интенсивностью принимается за 100 % (базовый пик), интенсивность остальных пиков пересчитывается пропорционально и выражается в процентах.
С ростом отношения m/z разница в отклонении магнитным полем частиц, различающихся на одну атомную единицу массы, уменьшается. В связи с этим важной характеристикой масс-спектрометров является их разрешающая способность (R) , определяющая максимальную массу ионов, различающихся на одну атомную единицу массы (для которой прибор разделяет пики не менее чем на 90%):
где М - максимальная масса, для которой перекрывание пиков менее 10%; ΔМ - одна атомная единица массы.
Стандартные приборы имеют R ≈ 5000/1, а для приборов с двойной фокусировкой потока ионов R ≈ 10000/1 и даже больше. Такие приборы способны уловить разницу в молекулярной массе ионов до 0,0001. Масс-спектрометр с двойной фокусировкой может легко разделить пики ионов с одинаковыми номинальными величинами молекулярных масс, но разным элементным составом. Например, может различить N 2 (28,0061), CO (27,9949), и C 2 H 4 (28,0313).
Установление эмпирической формулы по данным масс-спектров задача не простая, но ее можно решить, используя подходящий алгоритм. Для получения масс-спектра требуется ничтожно малое количество вещества - около 1 мкг.
2. Химическая ионизация (ХИ).
В этом методе образец до облучения пучком электронов разбавляют большим избытком «газа-реагента». Вероятность первичных ионизирующих столкновений между электронами и молекулами образца после этого настолько мала, что первичные ионы образуются почти исключительно из молекул реагента. В качестве реагентов обычно используют газы с низкой молекулярной массой, например, CH 4 , изо-C 4 H 10 , NH 3 и инертные газы (Ar, He). Вторичные ионы образуются в результате переноса атома водорода или электрона.
Если газом-реагентом служит метан, то реакции протекают в такой последовательности:
CH 4 + ē → CH 4 + + 2ē
CH 4 + + ē → CH 3 + + H + + 2ē
CH 4 + + CH 4 → CH 5 + + CH 3
CH 3 + + CH 4 → C 2 H 5 + + H 2
R-CH 3 + CH 5 + → R-CH 4 + + CH 4
где R-CH 3 - молекула исследуемого вещества.
Исследования показали, что частицы CH 5 + и C 2 H 5 + в сумме составляют около 90% ионов, присутствующих в этой системе. Масс-спектры, получаемые после химической ионизации, намного проще, содержат меньше пиков, и поэтому их часто легче интерпретировать.