Читая между строк ДНК [Второй код нашей жизни, или Книга, которую нужно прочитать всем] Шпорк Петер

Мир РНК

Когда Ханс Йорнваль, секретарь стокгольмского Нобелевского комитета, 2 октября 2006 года объявил новых лауреатов этой премии по медицине, по залу прокатился ропот. Такого решения ожидали немногие зрители: лауреатами оказались двое активных ученых лет по сорок с небольшим, чьи важнейшие публикации появились за восемь лет до того. Обычно награждают более заслуженных специалистов.

Тем не менее, по мнению большинства коллег, американцы Эндрю Файер из Стэнфордского университета (Калифорния) и Крейг Мелло из Медицинской школы Массачусетского университета получили высшее признание в своей области совершенно заслуженно. Все-таки они открыли абсолютно неизвестный до этого метод контроля активности генов - так называемую РНК-интерференцию.

РНК - сокращенное название рибонуклеиновой кислоты. Так называется младшая и чрезвычайно разносторонняя сестра ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). Молекулы РНК по химической структуре почти не отличаются от ДНК, но состоят из значительно более коротких цепочек нуклеотидов и менее устойчивы к изменениям. Они выполняли роль наследственного материала первых живых организмов на Земле, а простые вирусы по-прежнему используют их в этих целях.

Все виды РНК в основном имеют четко разграниченные функции и чрезвычайно важны для биохимии клетки. В отличие от ДНК они могут состоять не из двух цепочек с попарно связанными основаниями, но из одной нити с открытыми основаниями, а порой имеют форму петли. Ввиду многообразия молекул РНК биологи благоговейно говорят о целом мире РНК, который исследован еще далеко не полностью. Самые важные представители этого мира - уже упоминавшиеся матричные (информационные) и транспортные РНК. Появились и новые звезды - микро-РНК.

До открытия Файера и Мелло последних считали побочным продуктом, своего рода информационными РНК без информации, которые образуются, когда считывающие белки по ошибке переводят какой-нибудь участок мусорной ДНК в информационную РНК. Сегодня уже известно, что этот процесс происходит не случайно, а соответствующие участки ДНК - вовсе не мусор. Скорее они представляют собой третью важную систему переключателей эпигенетического кода.

Сначала клетка синтезирует две зеркальные нити микро-РНК, которые объединяются в так называемую двухцепочечную РНК. Эти молекулы, напоминающие короткую веревочную лестницу, выглядят точно так же, как наследственный материал вторгшихся в клетку вирусов, стремящихся размножиться с помощью биохимического аппарата инфицированных клеток и таким образом вызвать болезнь. Клетка борется с РНК таким же способом, как и с вирусами: появляется фермент под названием дайсер (гранулятор) и разбивает их на кусочки длиной от 21 до 27 нуклеотидов.

Большинство таких фрагментов уничтожаются клеткой. Но некоторые соединяются с мультибелковым комплексом RISC, который спасает их от уничтожения. Затем эти соединения отправляются на поиски подходящей им матричной РНК. Последняя в значительной степени идентична одной из цепочек исходной микро-РНК, а потому в ней где-то обязательно найдется участок, парный одному из многих получившихся фрагментов. Как только нужная молекула обнаруживается, она приклеивается к соответствующему фрагменту РНК, как бедная муха к липучке. В заключение по-прежнему присоединенный к фрагменту RISC осуществляет быструю расправу - он превращает матричную РНК в кучку нуклеотидного мусора, который мгновенно собирают и перерабатывают пустые транспортные РНК.

Теперь клетка не может синтезировать белок, закодированный в матричной РНК. Соответствующий ген молчит, хотя на уровне ДНК постоянно происходит его считывание.

Но и это еще не все. С помощью своих микро-РНК клетка может не только запустить или остановить синтез того или иного белка, как она это делает при помощи других эпигенетических переключателей. Клетка способна также немного подавить активность гена. Чем больше липучек она выкладывает против конкретной матричной РНК, тем меньше соответствующих ей закодированных молекул достигает цели и тем меньше конкретного белка будет синтезировано.

Крейг Мелло и Эндрю Файер назвали этот механизм генной регуляции РНК-интерференцией, потому что в ходе процесса две отвечающие друг другу молекулы - матричная РНК и микро-РНК - выключают друг друга точно так же, как во время физической интерференции взаимно ослабляются встречные волны. Исследователи выявили этот принцип в результате опыта: они вводили круглым червям двухцепочечные РНК и установили, что после этого синтез определенных белков идет на убыль.

Сначала никто не догадывался о далеко идущих последствиях открытия. Все это, вероятно, «какой-то странный механизм, свойственный только червям», решили сами исследователи. Скорее всего, в нормальной жизни животных он не играет никакой роли, поскольку происходит только в рамках эксперимента. Однако ученые сильно ошибались. Многие специалисты бросились изучать этот эффект и за короткое время выявили множество новых подробностей.

Очевидно, еще в незапамятные времена своего рода праклетка выработала механизм взаимного выключения рибонуклеиновых кислот, чтобы помешать вирусным генам, спасшимся от фермента дайсера и успешно внедренным в ДНК, реализовать свои «монтажные схемы» и вызвать болезнь. Видимо, некоторое время спустя другие клетки пришли к тому, чтобы с помощью микро-РНК регулировать и собственную систему считывания генов.

Одна из основных задач РНК-интерференции заключается в отключении транспозонов. Это те самые заново собранные, чрезвычайно подвижные гены и их фрагменты, которые активируются только в случае экстремального ухудшения внешней среды, чтобы помочь эволюции выкрутиться из этой ситуации.

«На сегодняшний день точно определены около трехсот пятидесяти микро-РНК, вероятно, окончательное число окажется в диапазоне от пятисот до тысячи», - заявил в интервью журналу «Спектрум дер виссеншафт» («Спектр науки») немецкий биохимик Томас Тушль из Рокфеллеровского университета (Нью-Йорк), один из ведущих исследователей РНК-интерференции в мире. Помимо прочего Тушль обнаружил, что выключатели из рибонуклеиновой кислоты есть и в человеческих клетках.

РНК-интерференция . Геном содержит не только гены, но и коды для микро-РНК. С помощью ферментов они разрушают соответствующие им матричные РНК и таким образом блокируют перевод гена в белок.

Сегодня уже известно, что принцип РНК-интерференции работает практически во всех живых организмах. А самые последние результаты свидетельствуют, что мир РНК куда важнее и разнообразнее, чем предполагалось. Выяснилось, что малые РНК служат также следопытами, указывая белкам вокруг ДНК те места, которые следует надежно блокировать или перепрограммировать. «Есть основания полагать, что РНК могут выполнять функцию якоря для различных белков, присоединяющих к хроматину метильные или ацетильные группы или снова удаляющих их», - разъясняет швейцарский эпигенетик Ренато Паро.

Происходит следующее: некоторые фрагменты микро-РНК попадают обратно в клеточное ядро и становятся великими устроителями эпигенома. Отрезки РНК уверенно и точно присоединяются к определенным участкам ДНК, прежде всего к своим зеркальным копиям. Причем эти удальцы тянут за собой на буксире специальные белки, побуждающие наследственное вещество, например, свернуться в клубок - деактивированный, плотно упакованный гетерохроматин. Таким образом они могут на долгое время отключать целые участки ДНК.

Томас Тушль считает, что микро-РНК способны и на большее. Вероятно, они - «важный фактор возникновения различных заболеваний». «Перспективная цель» его собственного исследования - «изобразить карту микро-РНК во всем геноме, для всех здоровых и больных тканей, и определить их функции».

В системе РНК-интерференции Тушля особенно вдохновляет то, что, наряду с метилированием ДНК и гистоновым кодом, обнаружен третий путь воздействия внешних факторов на активность генов. «Возникает вопрос, нельзя ли объяснить большую часть генетических заболеваний через процесс регуляции и можно ли как-то управлять ими, - говорит ученый. Звучит сложно, но исследователь поясняет на примере: - Гипотеза такова: возможно, чтобы добиться небольшого, но действенного изменения модели активации гена против депрессии, достаточно регулярно заниматься спортом, стабилизируя уровень дофамина, ведь это вещество - важный фактор в лечении депрессии».

Этот пример возвращает нас к главному посылу науки о втором коде: тот, кто начинает жить по-новому, меняет свой обмен веществ и гормональную систему. А эти перемены оказывают долговременное воздействие на модели метилирования, модификации гистонов и микро-РНК, что, в свою очередь, может благотворно повлиять на тело и психику. Кстати, тот факт, что физическая активность часто уменьшает депрессии, уже доказан во многих научных работах. Эпигенетика позволяет объяснить подобные положительные эффекты, наступающие в результате изменения образа жизни.

Кандидат биологических наук С. ГРИГОРОВИЧ.

На самой ранней заре своей истории, когда человек приобрел разум, а с ним и способность к абстрактному мышлению, он стал пленником непреодолимой потребности все объяснить. Почему светят Солнце и Луна? Почему текут реки? Как устроен мир? Безусловно, одним из самых главных был вопрос о сути живого. Резкое отличие живого, растущего, от мертвого, неподвижного, слишком бросалось в глаза, чтобы его можно было проигнорировать.

Первый вирус, описанный Д. Ивановским в 1892 году, - вирус табачной мозаики. Благодаря этому открытию стало ясно, что существуют живые создания более примитивные, чем клетка.

Русский микробиолог Д. И. Ивановский (1864-1920), основоположник вирусологии.

В 1924 году А. И. Опарин (1894-1980) высказал предположение, что в атмосфере молодой Земли, состоявшей из водорода, метана, аммиака, углекислого газа и паров воды, могли синтезироваться аминокислоты, которые затем спонтанно соединились в белки.

Американский биолог Освальд Эвери убедительно продемонстрировал в опытах с бактериями, что именно нуклеиновые кислоты отвечают за передачу наследственных свойств.

Сравнительная структура РНК и ДНК.

Двумерная пространственная структура рибозима простейшего организма Tetrahymena.

Схематическое изображение рибосомы - молекулярной машины для синтеза белка.

Схема процесса "эволюции в пробирке" (селекс-метод).

Луи Пастер (1822-1895) первым обнаружил, что кристаллы одного и того же вещества - винной кислоты - могут иметь две зеркально-симметричные пространственные конфигурации.

В начале 1950-х годов Стенли Миллер из Чикагского университета (США) проделал первый эксперимент, моделирующий химические реакции, которые могли протекать в условиях молодой Земли.

Хиральные молекулы, например аминокислоты, зеркально симметричны, как левая и правая рука. Сам термин "хиральность" происходит от греческого слова "хирос" - рука.

Теория РНК-мира.

Наука и жизнь // Иллюстрации

На каждом этапе истории люди предлагали свое решение загадки появления жизни на нашей планете. Древние, не знавшие слова "наука", находили для неизвестного простое и доступное объяснение: "Все, что есть вокруг, было когда-то и кем-то создано". Так появились боги.

Со времен зарождения древних цивилизаций в Египте, Китае, затем и в колыбели современной науки - Греции, вплоть до Средних веков, основным методом познания мира служили наблюдения и мнения "авторитетов". Постоянные наблюдения однозначно свидетельствовали, что живое при соблюдении определенных условий появляется из неживого: комары и крокодилы - из болотной тины, мухи - из гниющей пищи, а мыши - из грязного белья, пересыпанного пшеницей. Важно лишь соблюсти определенную температуру и влажность.

Европейские "ученые" Средневековья, опираясь на религиозную догму о сотворении мира и непостижимости божественных замыслов, считали возможным спорить о зарождении жизни только в рамках Библии и религиозных писаний. Суть сотворенного Богом невозможно постичь, а можно лишь "уточнить", пользуясь сведениями из священных текстов или находясь под влиянием божественного вдохновения. Проверять гипотезы в то время считалось плохим тоном, и всякая попытка подвергнуть сомнению мнение святой церкви рассматривалась как дело небогоугодное, ересь и святотатство.

Познание жизни топталось на месте. Вершиной научной мысли в течение двух тысяч лет оставались достижения философов Древней Греции. Наиболее значимыми из них были Платон (428/427 - 347 гг. до н. э.) и его ученик Аристотель (384 - 322 гг. до н. э.). Платон в числе прочего предложил идею одушевления изначально неживой материи благодаря вселению в нее бессмертной нематериальной души - "психеи". Так появилась теория самозарождения живого из неживого.

Великое для науки слово "эксперимент" пришло с эпохой Возрождения. Две тысячи лет понадобились для того, чтобы человек решился усомниться в непреложности авторитетных утверждений ученых древности. Одним из первых смельчаков, известных нам, стал итальянский врач Франсиско Реди (1626 - 1698). Он провел чрезвычайно простой, но эффектный опыт: поместив в несколько сосудов по куску мяса, одни из них накрыл плотной тканью, другие - марлей, а третьи оставил открытыми. Тот факт, что личинки мух развивались только в открытых сосудах (на которые могли садиться мухи), но не в закрытых (к которым все же был доступ воздуха), резко противоречил верованиям сторонников Платона и Аристотеля о непостижимой жизненной силе, носящейся в воздухе и превращающей неживую материю в живую.

Этот и подобные ему опыты положили начало периоду ожесточенных сражений между двумя группами ученых: виталистами и механистами. Суть спора состояла в вопросе: "Может ли функционирование (и появление) живого быть объяснено физическими законами, применимы ми также и к неживой материи?" Виталисты отвечали на него отрицательно. "Клетка - только из клетки, все живое - только от живого!" Это положение, выдвинутое в середине XIX века, стало знаменем витализма. Самое парадоксальное в этом споре то, что даже сегодня, зная о "неживой" природе составляющих наш организм атомов и молекул и в общем согласившись с механистической точкой зрения, ученые не имеют экспериментального подтверждения возможности зарождения клеточной жизни из неодушевленной материи. Никому еще не удалось "составить" даже самую примитивную клетку из "неорганических", присутствующих вне живых организмов, "деталей". А значит, окончательную точку в этом эпохальном споре еще предстоит поставить.

Так как же могла возникнуть жизнь на Земле? Разделяя позиции механистов, легче всего конечно же представить, что жизнь сначала должна была возникнуть в какой-нибудь очень простой, примитивно устроенной форме. Но, несмотря на простоту строения, это все же должна быть Жизнь, то есть то, что обладает минимальным набором свойств, отличающих живое от неживого.

Каковы же они, эти критически важные для жизни свойства? Что, собственно, отличает живое от неживого?

До конца XIX века ученые были убеждены, что все живое построено из клеток, и это является самым очевидным отличием его от неживой материи. Так считали до открытия вирусов, которые, хотя и меньше всех известных клеток, могут активно заражать другие организмы, размножаться в них и производить потомство, обладающее такими же (или очень похожими) биологическими свойствами. Первый из обнаруженных вирусов, вирус табачной мозаики, описан русским ученым Дмитрием Ивановским (1864-1920) в 1892 году. С той поры стало ясно, что более примитивные создания, чем клетки, могут также претендовать на право называться Жизнью.

Открытие вирусов, а затем и еще более примитивных форм живого - вироидов позволило в итоге сформулировать минимальный набор свойств, которые необходимы и достаточны, чтобы исследуемый объект можно было назвать живым. Во-первых, он должен быть способен к воспроизводству себе подобных. Это, однако, не единственное условие. Если бы гипотетическая первородная субстанция жизни (например, примитивная клетка или молекула) была способна лишь просто производить свои точные копии, она в итоге не смогла бы выжить в меняющихся условиях окружающей среды на молодой Земле и образование других, более сложных форм (эволюция) стало бы невозможным. Следовательно, нашу предполагаемую примитивную "субстанцию первожизни" можно определить как нечто, устроенное максимально просто, но при этом способное изменяться и передавать свои свойства потомкам.

Общепринятого определения жизни нет. Нам известна только одна жизнь - земная, и мы не знаем, какие из ее свойств являются обязательными для любой жизни вообще. Можно предположить два таких свойства. Это, во-первых, наличие наследственной информации, во-вторых - активное осуществление функций, направленных на самоподдержание и размножение, а также на получение энергии, необходимой для выполнения всей этой работы.

Все живое на Земле справляется с перечисленными задачами при помощи трех классов сложных органических соединений: ДНК, РНК и белков. ДНК взяла на себя первую задачу - хранение наследственной информации. Белки отвечают за вторую: они выполняют все виды активных «работ». Разделение труда у них очень строгое.

Молекулы третьего класса веществ - РНК - служат посредниками между ДНК и белками, обеспечивая считывание наследственной информации. При помощи РНК осуществляется синтез белков в соответствии с записанными в молекуле ДНК «инструкциями». Некоторые из функций, выполняемых РНК, очень похожи на функции белков (активная работа по прочтению генетического кода и синтезу белка), другие напоминают функции ДНК (хранение и передача информации). И все это РНК делает не в одиночку, а при активном содействии со стороны белков. На первый взгляд РНК кажется «третьей лишней». В принципе нетрудно представить себе организм, в котором РНК вовсе нет, а все ее функции поделили между собой ДНК и белки. Правда, таких организмов в природе не существует.

Какая из трех молекул появилась первой? Одни ученые говорили: конечно, белки, ведь они выполняют всю работу в живой клетке, без них жизнь невозможна. Им возражали: белки не могут хранить наследственную информацию, а без этого жизнь и подавно невозможна! Значит, первой была ДНК!

Ситуация казалась неразрешимой: ДНК ни на что не годна без белков, белки - без ДНК. Получалось, что они должны были появиться вместе, одновременно, а это трудно себе представить. Про «лишнюю» РНК в этих спорах почти забыли.

Потом, правда, выяснилось, что у многих вирусов наследственная информация хранится в виде молекул РНК, а не ДНК. Но это посчитали курьезом, исключением. Переворот произошел в 80-х годах XX века, когда были открыты рибозимы - молекулы РНК с каталитическими свойствами. Рибозимы - это РНК, выполняющие активную работу, то есть то, что должны делать белки.

В итоге РНК из «почти лишней» стала «почти главной». Оказалось, что она, и только она, может выполнять сразу обе главные жизненные задачи - и хранение информации, и активную работу. Стало ясно, что возможен полноценный живой организм, не имеющий ни белков, ни ДНК, в котором все функции выполняются только молекулами РНК. Конечно, ДНК лучше справляется с задачей хранения информации, а белки - с «работой», но это уже детали. РНК-организмы могли приобрести белки и ДНК позже, а поначалу обходиться без них.

Так появилась теория РНК-мира, согласно которой первые живые существа были РНК-организмами без белков и ДНК. А первым прообразом будущего РНК-организма мог стать автокаталитический цикл, образованный самовоспроизводящимися молекулами РНК - рибозимами, способными катализировать синтез собственных копий.

Лично я считаю теорию РНК-мира одним из самых выдающихся достижений теоретической мысли в биологии. По правде сказать, могли бы до этого додуматься и раньше. Ведь два вида рибозимов были известны еще с 60-х годов ХХ века, хотя их не называли тогда рибозимами. Это рибосомные РНК (рРНК), из которых сделаны молекулярные «машинки» для трансляции (синтеза белка) - рибосомы, и транспортные РНК (тРНК), которые подносят нужные аминокислоты к рибосомам в ходе трансляции.

Теория РНК-мира, вначале чисто умозрительная, быстро «обрастает» экспериментальными данными. Химики научились получать рибозимы чуть ли не с любыми желаемыми характеристиками. Делается это так. Например, мы хотим создать молекулу РНК, которая способна безошибочно узнавать вещество Х и связываться с ним. Для этого синтезируют большое количество разных цепочек РНК, соединяя рибонуклеотиды друг с другом в случайном порядке. Раствор, содержащий полученную смесь молекул РНК, наливают на поверхность, покрытую веществом Х. После этого остается лишь отобрать и исследовать те молекулы РНК, которые прилипли к поверхности. Технология незамысловата, но она действительно работает. Примерно таким способом получены рибозимы, катализирующие синтез нуклеотидов, присоединяющие аминокислоты к РНК и выполняющие множество других биохимических функций.

В последние годы всё больше сторонников находит эта теория возникновения жизни, становясь господствующей в решении этого вопроса. Суть её состоит в том, что основоположниками жизни являлись не белки, а молекулы РНК. Образование компонентов мономерных звеньев РНК - углеводных циклов рибозы и гетероциклических оснований - как уже показано, не представляло принципиальных затруднений. Значительно труднее представить себе процесс образования из них непосредственно нуклеозидов, а затем и соединение последних в НК. Действительно, в условиях гомофазного процесса в газовой или жидкой среде такой синтез мог оказаться крайне затруднительным. Однако он относительно легко осуществляется в условиях гетерофазного катализа на твёрдой подложке. В качестве последней выступают многие минералы земной коры: карбонат кальция, каолинит, монтмориллонит, соединения алюминия, цеолиты. При этом они способствуют не только ускорению синтеза, но и правильной ориентации реагирующих компонентов. На таких подложках осуществлялась сшивка сначала нуклеозидов, а затем и образование межнуклеотидной связи при участии фосфорной кислоты или её производных. Например, удалось осуществить синтез олигоцитидина, т. е. короткой молекулы РНК, состоящей только из одного типа нуклеозидов, на монтмориллонитовой подложке из 5"-фосфоримидазолида цитидина. Аналогично были получены и более сложные олигонуклеотиды, содержащие нуклеозиды разных типов. Интересно, что РНК-цепь сохранялись стабильной очень длительное время. При этом длинные олигонуклеотиды, находясь на минеральной матрице, могли связываться с ди- и тринуклеотидами путём образования водородных связей между комплементарными основаниями. Между этими ди- и тринуклеотидами также могли образовываться межнуклеотидные связи. Так осуществлялся синтез дочерней РНК на РНК-матрице, т. е. аналог транскрипции. Подобная последовательность операций могла иметь место и в случае матрично-направленного синтеза пептидов на РНК: отдельные ди- и тринуклеотиды связывались с молекулами АК, например, за счёт гидрофобных взаимодействий или водородных связей и переносили их к РНК-матрице. С молекулой РНК ди- и тринуклеотиды взаимодействовали посредством водородных связей. В результате около цепи РНК выстраивалить нуклеотиды, несущие АК. Если они располагались близко друг от друга, то становилось возможным образование пептидных связей между молекулами АК с образованием полипептида - небольшого „белка“. Таким образом реализовывалась реакция трансляции, причём без участия белков-ферментов. Здесь особенно важно подчеркнуть, что все эти процессы осуществлялись высокоспецифично, т. к. само образование водородных связей между различными молекулами является достаточно селективным: наиболее устойчивы те взаимодействия, в которых реализуется наибольшее число водородных связей. В условиях равновесности процессов такая избирательность приводила к воспроизведению определённых молекул: каждая матрица „производила“ присущие только ей продукты. Такой синтез мог проходить в первичных каплях-коацерватах. Это приводило к накоплению чётко очерченного набора биомолекул в каждой из них, однако разнообразие самих капель и условий, в которых они существовали, давало большие возможности для отбора наиболее устойчивых капель, что являлось уже протоэволюцией. Самовоспроизводящиеся делением капли всё увеличивались в размерах и постоянно усложнялись, вовлекая в себя новые и новые вещества. Таким путём могла возникнуть первая клетка.

Существует, однако, неясность, была ли РНК первой жизнеобразующей молекулой или существовали более древние предшественники. Некоторое время тому назад был осуществлён синтез вещества-химеры, называемого пептидонуклеиновая кислота (ПНК), в котором скелет цепи был образован молекулами аминокислоты, N-(2-аминоэтил)глицина, и к этому скелету крепились гетероциклические основания. Таким образом, сахарофосфатный остов был заменён на полипептидный. В настоящее время некоторые исследователи считают ПНК кандидатом на роль возможного предшественника РНК, хотя пребиотическая роль ПНК ещё строго не доказана.

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Идея того, что жизнь могла возникнуть на основе самореплицирующихся молекул РНК, уже не нова. В самом деле, РНК совмещает в себе как функцию хранения наследственной информации, так и способность к биохимическому катализу. Сейчас гипотеза РНК-мира из чисто умозрительной теории превратилась в теоретическую модель, имеющую хорошую доказательную и экспериментальную базу. Безусловно, эта теория вызывает много вопросов, но, тем не менее, она по полному праву может быть названа одной из наиболее обоснованных гипотез возникновения жизни на Земле.

Противоречия гипотезы мира РНК

Идея мира РНК была высказана в 1968 году Карлом Вёзе , а окончательно сформулирована в 1986 году нобелевским лауреатом Уолтером Гильбертом . То, что РНК способна как хранить наследственную информацию, так и выполнять работу (например, при биосинтезе белка), было известно и ранее. Но окончательно гипотеза мира РНК смогла сформироваться лишь после открытия в 1981 году рибосомальной РНК из ресничного простейшего Tetrahymena , которая способна к автосплайсингу . Осуществляется это следующим образом: к интронной последовательности РНК прикрепляется нуклеотид G, далее цепь разрезается в месте присоединения нуклеотида. После этого происходит окончательное вырезание интрона и сшивание экзонов. Более того, эта интронная последовательность обладает рибонуклеазной активностью, т.е. она способна связываться с субстратной РНК и специфично разрезать её. Такие свойства рибонуклеиновому интрону придаёт его способность к образованию сложных трёхмерных структур.

Однако платой за высокую лабильность РНК служит её склонность к быстрой деградации. Здесь мы и сталкиваемся с первой трудностью концепции РНК-мира. Как молекула может служить надёжным хранилищем генетической информации, если время её жизни мало?

У млекопитающих время жизни мРНК в клетках составляет от нескольких минут до нескольких часов, максимум дней. У бактерий и вовсе, мРНК «живёт» от нескольких секунд до часа с небольшим. Согласитесь, недолго для надёжного хранилища информации! Тем более, в пребиотических условиях, агрессивная среда которых мало способствовала стабильности молекул.

Это противоречие способны разрешить некоторые предположения. Считается, что первые РНК могли размножаться в микрополостях во льду. В подтверждение этому, по данным ряда экспериментов, максимальная рибозимная активность РНК наблюдается при температуре около −8 °С. Возможно, это связано с тем, что при подобных температурах увеличивается концентрация РНК и понижается активность воды. Однако вероятная сложность здесь заключается в том, что РНК при низких температурах обретают повышенную склонность к образованию водородных связей между комплементарным нуклеотидами, что ведёт к образованию межмолекулярных комплексов и снижению каталитической активности .

Следующей большой трудностью является склонность РНК к гидролизу при pH>6. Фосфодиэфирные связи между нуклеотидами наиболее стабильны при рН, лежащих в пределах 4–5.

Также двоякую роль играют и ионы Mg 2+ : с одной стороны, они стабилизируют вторичную и третичную структуры РНК (что критично для способности к катализу), с другой же, их высокая концентрация способствует деградации молекул. Выше упоминалось, что молекулы РНК наиболее стабильны в кислой среде. В этих условиях цитозин и аденозин протонируются, тем самым обретая дополнительный положительный заряд, что снижает потребность в катионах. К примеру, при рН=4 некоторые рибозимы сохраняют свою активность даже в отсутствие ионов .

РНК является весьма сложной молекулой, и вероятность её внезапного возникновения из отдельных атомов или фрагментов крайне низка. Действительно, сложно себе представить, как могли соединиться вместе азотистое основание, рибоза и фосфат, образовав нуклеотид. Однако Санчез, Оргел, Паунер и Сазердэнд показали возможность синтеза пиримидинов из молекул, вероятно, имевшихся в пребиотических условиях Земли .

Также важно понять, каким образом осуществлялась полимеризация первых нуклеотидов в полимерные цепочки. Относительна недавно была обнаружена важная роль различных минералов и ионов металлов в катализе при образовании биополимеров . К примеру, монтмориллонит катализирует полимеризацию нуклеотидов, 5′-фосфат которых ранее был активирован имидазолом. Более того, монтмориллонит способен образовывать везикулы из простых жирных кислот . Таким образом, этот минерал, с одной стороны, способствует полимеризации нуклеотидов, а с другой - образованию мембранных структур.

Гипотетически, существует множество вариантов соединения рибонуклеотидов друг с другом через различные атомы рибозы. Однако в живых организмах нуклеотиды соединены друг с другом через 3′,5′-фосфодиэфирную связь (за некоторыми исключения: например, кэп в мРНК эукариот присоединяется через 5′,5′-связь). Недавние исследования Шостака показали, что рибозимы, имеющие в своём составе нуклеотиды, соединённые как через 3′,5′-связь, так и через 2’,5′-связь, частично сохраняли каталитические свойства . Вероятно, в первых рибонуклеиновых полимерах могли реализовываться различные варианты фосфодиэфирной связи, однако эволюцией была отобрана именно 3′,5′-связь.

Зачастую каталитической активностью обладают лишь длинные цепочки РНК. Это один из основных объектов критики теории РНК-мира, ибо случайное возникновение длинных последовательностей, способных выполнять биохимическую работу, весьма маловероятно. Одна из лучших рибозимных репликаз, созданных на сегодня, способна реплицировать до 95 нуклеотидов , однако сама она при этом имеет длину в 190 нуклеотидов (см. врезку). Длина этой последовательности слишком велика для спонтанного возникновения в пребиотических условиях. Исследования in vitro показывают, что для выделения молекул, способных к катализу, требуется около 10 13 -10 14 молекул РНК - довольно много для того, чтобы столь длинный рибозим мог появиться в готовом виде. Однако открытие коротких рибозимов ставит под сомнение идею того, что для появления РНК-катлизаторов требуются астрономические количества молекул. В самом деле, получены полирибонуклеотиды c активными дуплексами, способными к самовырезанию, имеющие длину лишь 7 остатков . Более того, были получены данные, что даже рибозим, урезанный всего лишь до пяти нуклеотидов, сохранял свои ферментативные способности . Но каталитическая активность у минирибозимов значительно ниже, чем у их более длинных «собратьев». Из этого следует, что короткие рибозимы могли быть эволюционными предшественниками длинных. Со временем они приобрели бóльшую длину, которая способствовала обретению более правильной структуры и, как следствие, улучшению каталитических свойств.

Рибозимные репликазы

Для того, чтобы в мире РНК полирибонуклеотиды могли размножаться, должны были существовать рибозимные аналоги белковых полимераз. В современных живых организмах рибозимы с таким видом активности не обнаружены, однако подобные молекулы были созданы искусственно. Молекулярные биологи из Великобритании обратили внимание на ранее известный рибозим R18, обладающий полимеразной активностью . Он и стал объектом эксперимента: путём искусственной эволюции и разумного планирования из исходного рибозима были получены четыре новые молекулы с улучшенными каталитическими свойствами . Дело в том, что исходный рибозим R18 (обозначен на картинке буквой А) был способен реплицировать лишь фрагменты РНК длиной до 20 нуклеотидов. Также им могла быть реплицирована далеко не каждая последовательность РНК, а лишь узкий круг определённых матриц . Учёные пошли двумя путями:

В результате, полезные свойства рибозимов tC19 и Z удалось объединить в одном, названном tC19Z. Данный рибозим способен копировать как довольно широкий круг матриц, так и достаточно длинные последовательности .

Интроны, способные вырезаться самостоятельно, были обнаружены в тирозиновой тРНК таких сложных организмов, как человек и цветковое двудольное растение Arabidopsis thaliana . Эти 12-ти и 20-ти нуклеотидные участки в клетке вырезаются путём сплайсинга с участием белков, однако этот интрон показал способность вырезать самого себя и без участия ферментов.

РНК-переключатели

Ограниченная каталитическая способность рибозимов часто становится ещё одним хлипким краеугольным камнем теории мира РНК. Критики теории считают, что тот минимум химических реакций, который необходим для осуществления метаболизма в мире РНК, не может быть обеспечен одними лишь рибозимами. Подавляющее большинство РНК-катализаторов катализируют лишь разрыв и создание фософодиэфирных связей между нуклеотидами. Кажется, что молекулы РНК со своими четырьмя весьма схожими мономерами безнадёжно проигрывают в химическом разнообразии белкам, которые имеют в своём составе 20 аминокислот, весьма различных по свойствам. Однако не стоит забывать, что многие белковые ферменты для выполнения активной работы должны присоединить лиганды - кофакторы , - без которых ферментативная активность попросту исчезает.

И здесь стоит вспомнить об РНК-перключателях или рибопереключателях (англ. riboswitches ). Что же это такое? Как известно, информация об аминокислотной последовательности белка передаётся в рибосому через мРНК . Матричная РНК транскрибируется с ДНК посредством фермента ДНК-полимераза II . В данном случае, помимо самого гена, транскрибируется участок впереди него, на котором и расположен рибоперключатель . РНК-переключатель представляет собой участок мРНК, способный связывать молекулу строго определённого вещества. После связывания переключатель меняет свою пространственную конфигурацию, что делает невозможной дальнейшую транскрипцию .

Важно понимать принцип работы РНК-переключателей, поэтому скажем пару слов об их устройстве. Состоит он из двух частей: из аптамера и «экспрессионной платформы». Аптамер, по сути, является рецептором, который с очень высокой селективностью связывается с определённой молекулой. Эффекторной молекулой для аптамера является молекула, производимая белком, ген которого и регулируется переключателем. «Экспрессионная платформа» и есть сам РНК-переключатель, который после связывания рецептора с лигандом меняют конфигурацию и препятствует дальнейшей транскрипции.

Однако существуют и РНК-переключатели, действующие по более сложному механизму. Например, рибопереключатель, контролирующий транскрипцию гена metE бактерии Bacillus clausii , является двойным, т.е. имеет два рецепторных участка, связывающих две разных молекулы . Разберём данный механизм подробнее.

Ген metE кодирует фермент, превращающий гомоцистеин в аминокислоту метионин. Затем метионин используется (уже другим ферментом) для синтеза S-аденозилметионина (или проще - SAM). Помимо гена metE , существует и другой ген - metН . Белок гена metН катализирует ту же реакцию, но с большей эффективностью, чем metE . Однако metН для своей работы требует кофермент - метилкобаламин (или MeCbl), синтезируемый из аденозилкобаламина (или AdoCbl). Так вот, транскрипт metE имеет РНК-переключатель, который содержит два связывающих участка: один для SAM, другой - для AdoCbl. Данный переключатель способен действовать как логический элемент NOR (и/или) . То есть, для выключения metE достаточно связывания с рецепторами рибопереключателя либо одной из эффекторных молекул, либо сразу обеих. Сам механизм прерывания трансляции основан на образовании шпильки путём удаления шести нуклеотидов из рибопереключателя (рис. 1А). Логику действий такого элемента NOR можно описать так: «Я подавляю транскрипцию, если в среде присутствует либо вещество А, либо вещество В, либо оба вещества сразу» . Остаётся только удивляться, сколь красивы и элегантны решения Природы!

Рисунок 1. Работа рибопереключателей. А - Рибопереключатели на транскриптах генов metE, metH и metK. Голубым обозначены шпилечные структуры, образуемые в результате вырезания шести или более уридиновых нуклеотидов. Видно, что у metE имеется два акцепторных и два шпилечных участка. В - Путь биосинтеза S-аденозилметионина. На первом этапе гомоцистеин преобразуется в амикислоту метионин. Это превращение может быть катализировано одним из двух ферментов: metE или metH. metH проводит эту реакцию с большей эффективностью, однако требует для своей работы дополнительного вещества (кофактора). На втором этапе фермент metK превращает метионин в S-аденозилметионин.

Между тем, РНК-переключатели способны связывать значительное число белковых кофакторов, таких как флавинмононуклеотид, тиаминпирофосфат, тетрагидрофолат, S-аденозилметионин, аденозилкобаламин . Изначально считалось, что РНК-переключатели способны лишь подавлять экспрессию генов , но позже были получены данные, свидетельствующие о том, что некоторые переключатели, напротив, ее усиливают. Сами по себе РНК-переключатели представляют весьма интересное явление, так как они демонстрируют возможность регуляции работы генов без прямого участия белков - иными словами, демонстрирует самодостаточность и универсальность РНК. Судя по всему, РНК-переключатели являются очень древним механизмом: так, они обнаружены во всех доменах живой природы: у бактерий, архей и эукариот . Похоже, что, по меньшей мере, некоторые из современных кофакторов белков были прямиком заимствованы из мира РНК. Можно нарисовать примерно такую картину: рибозимы изначально использовали многие из современных кофаторов для своих целей, однако с появлением более эффективных белковых ферментов эти кофакторы были заимствованы последними.

Рисунок 2. Вторичная структура РНК-переключателя гена metE . Выделены акцепторы - сайты связывания с молекулами SAM и AdoCbl, а также шпилечные терминирующие структуры.

Геномные тэги и тРНК

Рисунок 3. Вторичная структура тРНК. На рисунке отчётливо видна характерная для тРНК вторичная структура в виде «клеверного листа». В верхней половине молекулы на 3′-конце расположена CCA-область и акцепторная петля, связывающая аминокислоту. В нижней части молекулы находится антикодоновая петля, ответственная за комплементарное связывание с кодоном мРНК. Согласно гипотезе геномного тэга, верхняя и нижняя половины тРНК эволюционировали по отдельности, причём верхняя половина древнее нижней.

Всем хорошо известна важная роль тРНК в биосинтезе белка. Однако у тРНК и подобных ей молекул есть другая, менее известная, но не менее важная функция: в различных репликативных процессах они исполняют роль праймеров и шаблонов. Это могут быть процессы репликации одноцепочечной вирусной РНК, репликация митохондриальной ДНК у грибов, репликации теломер .

Обратимся к вирусной РНК. 3′-конец многих бактериальных вирусов и вирусов растений структурно очень похож на «верхнюю половину» современной тРНК (та часть молекулы, которая связывается с аминокислотой; рис. 3). Подобные участки, расположенные на 3′-концах, названы «геномными тэгами» . Тэг играет роль шаблона при инициации репликации вирусной РНК. Более того, эти участки бывают настолько похожи на «настоящие» тРНК , что могут быть аминоацилированы (т.е. к ним может быть присоединена аминокислота) при помощи фермента аминоацил-тРНК-синтетазы .

Также репликация многих РНК у ретровирусов начинается с того, что к сайту связывания праймера на вирусной РНК присоединяется тРНК хозяйского организма . Тем самым видно, что тРНК современных организмов способны также служить и праймерами. Затем, используя тРНК как праймер, обратная транскриптаза копирует вирусный РНК-геном в ДНК.

Возможно ли, что тРНК сегодняшних организмов произошли от древних геномных тэгов? Алан Вейнер и Нэнси Мэйцелс отвечают на этот вопрос утвердительно. Согласно их теории, верхняя и нижняя половинки тРНК эволюционировали по-отдельности, причём верхняя часть тРНК появилась раньше нижней и является потомком геномных тэгов .

Происхождение рибосом

При построении гипотезы мира РНК много внимания уделяется и происхождению рибосом, потому что их образование фактически можно приравнять к переходу от РНК-катализа к белковому процессу. Как известно, рибосома состоит из двух субъединиц: малой и большой. Ключевую роль в синтезе белковой цепи играет большая субъединица рибосомы, в то время как маленькая считывает мРНК. Модель происхождения одной из молекул большой субъединицы была предложена канадскими биохимиками Константином Боковым и Сергеем Штейнбергом .

Они сосредоточили внимание на 23s-рРНК (состоящей из шести доменов, I–VI), так как именно в этой молекуле находится функциональный центр, ответственный за реакцию транспептидации (присоединение новой аминокислоты к растущей полипептидной цепи). Данная молекула содержит около трёх тысяч нуклеотидов и способна образовывать сложные трёхмерные структуры. Важную роль в поддержании трёхмерной структуры молекулы играют так называемые А-минорные связи . Они представляют собой связи между «стопками» нуклеотидов (как правило, аденозинов ) с участками, образующими двойные спирали. Связи формируются между спиралями и стопками, расположенными в разных областях молекулы.

23s-рРНК слишком сложна, чтобы она могла появиться сразу в готовом виде . Соответственно, в молекуле должна присутствовать некая более простая структура, с которой и началась её эволюция. Особое внимание исследователей привлёк домен V . Интересным в нём было то, что он содержит большое количество двойных спиралей при фактически полном отсутствии аденозиновых стопок. Вот что пишут по этому поводу авторы исследования: «Чтобы объяснить аномалию, имеющую место в домене V, мы предположили, что это отражает порядок, в котором различные части присоединялись к 23s-рРНК по мере её эволюции. В А-минорных мотивах конформационная стабильность аденозиновых стопок зависит от присутствия двойных спиралей, в то время как двойные спирали способны сохранять стабильную структуру сами по себе» . Из этого следует, что домен V является наиболее древней частью молекулы: его спиральные участки, что придают стабильность всей молекуле, должны были появиться раньше других частей, содержащих аденозиновые стопки. Более того, именно в пятом домене находится функциональный центр, ответственный за формирование пептидной связи в процессе биосинтеза белка.

Выходит, что пятый домен является и функциональным центром молекулы, и её структурным остовом. Это говорит о том, что эволюция 23s-рРНК началась именно с него. Далее авторы попытались реконструировать эволюцию 23s-рРНК. Для этого они разбили молекулу на 60 относительно небольших участков и попытались «разобрать» её так, чтобы, убирая части поэтапно, не повредить структуру оставшейся молекулы. Опустив детали, укажем, что вывод был именно такой: эволюция этой молекулы началась именно с пептидил-трансферазного центра пятого домена, так как при разборке он оставался последним неповреждённым участком (см. рис. 4). Исследователи считают, что именно эта структура и является древней «проторибосомой». Способна ли эта маленькая часть огромной молекулы выполнять свою работу самостоятельно? Исследования дают положительный ответ. В ходе экспериментов были получены искусственно выведенные рибозимы, способные осуществлять реакцию транспептидации .

Рисунок 4. Эволюция «проторибосомы». Слева - Вторичная структура 23s-рРНК. Красные кружочки изображают спиральные участки, жёлтые - аденозиновые «стопки». Голубые линии показывают А-минорные связи. Римские цифры обозначают домены молекулы. Отчётливо видно, что наибольшее количество спиральных участков находится в домене V. Справа - Для того чтобы выяснить процесс эволюции 23s-рРНК, авторы разбили молекулу на 60 структурных блоков. Далее они попытались «разобрать» молекулу так, чтобы при последовательном удалении этих блоков молекула продолжала работать . Сначала они отделили 19 блоков, не повредив при этом оставшиеся. После удалось отделить ещё 11 блоков, а затем ещё последовательно 9, 5, 3, 3, 2, 2, 2. Затем ещё три блока оказалось возможным отделить по одному .

По всей видимости, именно пятый домен послужил «стартовой точкой» в эволюции 23s-рРНК. Позже к нему начали добавляться различные блоки, улучшающие работы молекулы. Изначально к проторибосоме присоединилось восемь блоков, образовавших «основание», что повлекло за собой увеличение стабильности всей молекулы. Затем добавились следующие 12 блоков, которые образовали структуры, позволяющие соединяться большой и малой субъединицам друг с другом. Последними добавились блоки, образующие т.н. «протуберанцы» - выросты на поверхности большой субъединицы . Функция этих выростов в том, чтобы помочь рибосоме выбрать нужную аминоацил-тРНК, а также «выпустить на волю» ту тРНК, которая уже отдала свою аминокислоту растущей белковой молекуле.

Следы мира РНК

Наследие мира РНК можно обнаружить в любом живом организме. Вспомним рибосомы, которые, по всей видимости, являются реликтами очень давней эпохи, ведь структурно и функционально рибосомы крайне схожи и у человека, и у дождевого червя, и у кишечной палочки. Главный переносчик энергии в клетке - молекула аденозинтрифосфата - представляет собой не что иное, как аденозин с двумя дополнительными фосфатами. Такие важнейшие молекулы, как переносчики электронов ФАД и НАД также являются модифицированными нуклеотидами. Конечно, гипотеза мира РНК ещё не доказана, да и нет гарантий, что когда-нибудь это случится. Но факт того, что важнейшие процессы в клетке протекают при активном участии РНК и рибонуклеотидов, может служить веским доводом в пользу истинности этой теории.

Литература

1. Карл Вёзе (1928–2012) ;
2. Harold S Bernhardt. (2012). The RNA world hypothesis: the worst theory of the early evolution of life (except for all the others)a . Biology Direct . 7 , 23;
3. C. Briones, M. Stich, S. C. Manrubia. (2009). The dawn of the RNA World: Toward functional complexity through ligation of random RNA oligomers . RNA . 15 , 743-749;
4. Matthew W. Powner, Béatrice Gerland, John D. Sutherland. (2009). Synthesis of activated pyrimidine ribonucleotides in prebiotically plausible conditions . . Biol. Bull. 196 , 327–328;
5. Konstantin Bokov, Sergey V. Steinberg. (2009). A hierarchical model for evolution of 23S ribosomal RNA . Nature . 457 , 977-980;
6. Элементы: «